g/l、小于约200mg/l、小于约lOOmg/1，或小于约50mg/l的 浓度产生。
[0072] 在其它实施方案中，一些本文所述的肤可用文献中已知的多种方式表达。例 如，肤在细菌系统（包括大肠杆菌、棒状杆菌（corynebacterium)和巧光假单胞杆菌 (pseudomonasfluoresceins))中表达。大肠杆菌的表达平台可包括周质表达或细胞质表 达。对于周质表达，融合物可包括peIB、dsbA和ExFABP融合物。肤也可W在昆虫细胞系统 和真核系统（包括哺乳动物系统）中表达。
[0073] 在一些方面，本文公开的肤可通过转染引入，转染是一种设及将外来DNA引入真 核细胞细胞核的技术。在一些方面，肤可通过瞬时转染值NA不与真核细胞基因组整合，但 是基因表达24-96小时）来合成。可使用各种方法W将外来DNA引入宿主细胞，并且转染可 通过基于化学的手段（包括通过憐酸巧、通过树状聚合物、通过脂质体和通过使用阳离子 聚合物）来实现。转染的非化学方法包括电穿孔、声孔效应、光学转染、原生质体融合、穿刺 转染（impalefection)和流体动力学递送。在一些实施方案中，转染可通过包括基因枪的 基于颗粒的方法来实现，其中DNA与惰性固体的纳米颗粒偶联，所述纳米颗粒然后直接"射 击"到祀标细胞的细胞核。其它基于颗粒的转染方法包括磁铁辅助转染和穿刺转染。
[0074] 也可W使用病毒作为载体（病毒转导），使用逆转录病毒或慢病毒将DNA引 入细胞中。在一些实施方案中，可使用代达罗斯表达系统制备本发明的肤。Ashok D.Bandaranayake等，NucleicAcidsRes. 2011 年 11 月；39(21) :el43,其W引用的方式整 体并入本文。运种技术也可W与无血清哺乳动物培养系统组合。并且，还有可能表达无标 签蛋白，其可在单一尺寸排阻步骤中直接从培养基高水平纯化。
[0075]-方面，本发明提供一种W高水平制备几百到几千或更多肤变体的方法。制备打 结肤的常规方法可能受限之处在于打结肤的活性可取决于肤的正确折叠。在制备在制造期 间正确折叠的打结肤方面，成功有限。本发明克服了本领域中已知的其它技术所存在的运 些问题。图2示出了用于制备本发明的肤文库的实例方法。如所示，病毒可通过包装特异 性寡核巧酸序列、将所述序列转移到病毒W及表达肤来产生。可回收肤并对肤进行扩大培 养，然后可纯化和分析所述样本。可有效进行所述过程（例如在=周内），并且可产生大量 肤（例如200mg/l)。在一些情况下，由于根据本文所述的方法的制造纯度，因此可能不需要 色谱纯化。
[0076] 在一个实例实施方案中，本发明包括打结肤与隧铁蛋白通过可裂解连接子融合的 融合蛋白。图3示出了可用W制备打结肤文库的实例融合系统。如所示，融合系统包括包 含I巧SP、sFLAG、HIS、隧铁蛋白、TEV的序列，和所关注的打结肤序列。在一些实施方案 中，运些融合物可与代达罗斯表达系统组合。AshokD.Bandaranayake等，NucleicAcids Res. 2011年11月；39(21) :el43,其W引用的方式整体并入本文。可使用慢病毒W获得在 肥K293细胞，即人肾细胞系中快速稳定的表达。隧铁蛋白可在运个系统中高表达，并且例如 还用W帮助打结肤的表达。可裂解连接子的性质允许当蛋白质正在表达时或稍后通过外源 添加的蛋白酶而发生融合物裂解。隧铁蛋白融合伴侣可例如为用于任何表达困难的蛋白质 的可推广表达增强系统，可用作标签W增大较小肤的尺寸，和/或增加肤的血清半衰期（例 如通过增大最终融合蛋白的尺寸超过肾小球过滤限制来实现）。在一些实施方案中，融合 蛋白还包含I巧启动序列、sFLAG、HIS和TEV中的至少一种。在某些实施方案中，融合蛋白 包含W下构建体：1巧SP-S化AG-HIS-隧铁蛋白-TEP-肤。在一些实施方案中，肤包含打结 肤。
[0077] 虽然肥K293细胞是稳健的并且用于一般蛋白质表达，但是慢病毒可感染多种细 胞。将此与允许蛋白质表达时裂解的系统组合可实现一组强大的分析，所述分析依赖于 分泌的肤W用自分泌或旁分泌方式起作用（即其作用于分泌其的细胞或作用于附近的细 胞）。其一个实例将用表达肤的慢病毒的文库感染癌症祀标细胞，然后对有细胞调亡迹象 的那些通过流式细胞术来筛选那些细胞（例如，膜联蛋白V表达）。可挑选出有调亡应激 迹象的细胞并且对其进行病毒测序，从而基本上寻找表达W自分泌方式诱导调亡的肤的细 胞。可在扩散限制性基质（例如软琼脂）中进行相关组的筛选，其中将表达肤的细胞与祀 标细胞混合并且琼脂限制肤扩散。祀标细胞死亡的面积将是活性分泌肤的指标。W此方式 进行的筛选可采用极大型文库，因为解卷积（deconvolution)将与作为肤来源的基因的测 序一样简单。
[0078] 在一些实施方案中，本发明可包括用于产生打结素W使打结素蛋白可保持栓系于 用于常规结合筛选的哺乳动物细胞的表面的方法（例如W下那些：其中祀标分子栓系于管 柱或珠粒并且候选药物通过对祀标的亲和力来鉴别）。与其它已知方法（例如隧菌体或酵 母展示）相反，本文所述的方法使用融合系统（例如本发明的隧铁蛋白系统）来表达肤文 库，所述肤文库已经根据如上所述的"规则"（例如肤中酸性/碱性氨基酸的比率）设计并 且可通过体内药物发现过程确立和/或已经针对特定生物物理和药理性质进行预筛选。在 运些方法中，例如所有DNA序列和蛋白质产品都是已知的并且已经得到验证（例如肤都正 确折叠和具有增加的血清半衰期）。本发明的方法与其它已知展示技术形成直接对比，在所 述其它已知展示技术中，所展示的蛋白质是未知的并且先前未得到验证，并且代之W其序 列是随机化的（使用诱变寡核巧酸和简并NNN密码子），从而得到尺寸巨大的文库（一般大 于1〇7)，其中许多蛋白质因有害的突变而没有正确折叠。
[0079] 制备打结肤和相关组合物的方法
[0080] 本公开的融合系统可用于各个方面W产生肤、打结素和细胞质和分泌的蛋白质。 在一些方面，本文所述的方法和组合物包括祀标蛋白质和/或肤与脂质运载蛋白的融合 物，W使脂质运载蛋白有助于细胞对祀标蛋白质的表达和分泌。例如，脂质运载蛋白具有特 征在于具有侧接a螺旋的八股P筒的保守折叠，并且支撑通用支架。在一些方面，脂质运 载蛋白融合蛋白系统使得哺乳动物细胞中的融合蛋白表达大于没有使用脂质运载蛋白融 合蛋白的系统。例如，脂质运载蛋白融合蛋白系统使得哺乳动物细胞中的融合蛋白表达比 缺乏脂质运载蛋白融合蛋白的系统大0.5倍W下、大1倍、大2倍、大3倍、大4倍、大5倍、 大6倍、大7倍、大8倍、大9倍、大10倍、大11倍、大12倍、大13倍、大14倍、大15倍、大 16倍、大17倍、大18倍、大19倍、大20倍、大25倍、大30倍、大35倍、大40倍、大45倍、 大50倍、大55倍、大60倍、大65倍、大70倍、大75倍、大80倍、大85倍、大90倍、大95 倍、大100倍、大200倍、大300倍、大400倍、大500倍、大600倍、大700倍、大800倍、大 900倍或1000倍。
[0081] 在一些方面，脂质运载蛋白（例如SCN)可用作融合伴侣W使作为免疫原的所关注 的蛋白质或肤稳定。在各方面，产生所述脂质运载蛋白序列的物种不同于接受物种。在一 些方面，产生所述脂质运载蛋白序列的物种与接受物种相同。
[0082]SCN和相关蛋白质当用作分泌伴侣时有利地提高所分泌的蛋白质和肤的产量。此 外，SCN和相关蛋白质有利地是小的，从而提高其生物利用率。例如，成熟蛋白质是178个氨 基酸并且分子量为20547Da。SCN具有提高其稳定性的单一分子内二硫键，W及单一N-连 接糖基化位点。
[0083] 在一些方面，脂质运载蛋白2 (SCN)的天然序列中的至少一个氨基酸可取代为非 天然氨基酸。在一些方面，可产生突变W防止SCN发生二聚体化。例如，一种SCN蛋白可 与另一SCN蛋白在半脫氨酸残基处发生二聚体化，或一种SCN蛋白可与不同蛋白质在半脫 氨酸残基处发生二聚体化。例如，在SCN中产生C87S突变可防止在半脫氨酸残基处的二 聚体化（参见Goetz,D.H.等，^HieNeutrophilLipocalinNGALisaBacteriostatic AgentthatInterfereswithSiderophore-mediatedIronAcquisition'Molecular Cell(2002) 10 ： 1033-43)〇
[0084] 在一些方面，与人SCN直系同源的非人脂质运载蛋白的天然序列中的至少一个 氨基酸可取代为非天然氨基酸。例如，可与本文所述的方法和组合物一起使用的人脂质 运载蛋白的非人直系同源体包括但不限于鼠Lcn2(例如24p3)、Lcnl、Lcn6、Lcn8、Lcn9、 LcnlO、Lcnl2和Lcnl5(参见图14)。在一些方面，可产生突变W防止与人SCN直系同源 的非人脂质运载蛋白发生二聚体化。例如，一种与人SCN蛋白直系同源的非人脂质运载蛋 白可与另一与人SCN蛋白直系同源的非人脂质运载蛋白在半脫氨酸残基处发生二聚体化， 或一种与人SCN蛋白直系同源的非人脂质运载蛋白可与不同蛋白质在半脫氨酸残基处发 生二聚体化。例如，在与人脂质运载蛋白中的C87S突变直系同源的位点处产生突变可防 止在半脫氨酸残基处发生二聚体化（参见Goetz,化H.等，'化eNeutrophilLipocalin NGALisaBacteriostaticAgentthatInterfereswithSiderophore-mediatedIron Acquisition^MolecularCell(2002) 10 ：1033-43) 〇
[0085] 在一个示例性方面，脂质运载蛋白融合蛋白可含有W下蛋白质序列：
[0086]MPL化LWLGLA化GALHAQA孤STSDLIPAPPLSKV化QQNF孤NQFQGKWYYVGLAGNAILRED邸PQ KMYA11YELK邸KSYNVTSVLF服KK邱YWIRTFVPG控QPGEFTLGN化SYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKV SQNREYFKITLYGRT邸LT沈LKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQ￡IDG
[0087] 在运个序列中，注解表示值旦化、糖基化位点、二硫键矛口C8巧黎变。
[0088] 在一些方面，所关注的蛋白质或肤与脂质运载蛋白的融合物可改善祀标蛋白质 (例如潜在的治疗剂）的生物性质。例如，所关注的蛋白质或肤与脂质运载蛋白的融合物 可通过增大总体蛋白质的尺寸来增加所关注的蛋白质或肤的半衰期。例如，蛋白质的尺 寸增大可防止所关注的蛋白质或肤的肾小球过滤作用。在一些方面，小蛋白质（如抗体 片段）的融合物显示降低的肾小球过滤作用。对于酶和Fab抗体片段两者都观测到运些 作用。在一些实施方案中，融合蛋白还包含选自W下的肤：1巧启动序列、sFLAG、HIS、隧 铁蛋白、TEV和所关注的打结肤序列。在某些实施方案中，融合蛋白包含W下构建体：1巧 SP-S化AG-HIS-隧铁蛋白-TEV-肤。在一些实施方案中，打结肤包括至少两个二硫键。
[0089] 在一些实施方案中，融合蛋白还包含I巧启动序列、sFLAG、HIS和TEV中的至少一 种。在某些实施方案中，融合蛋白包含W下构建体：I巧SP-S化AG-HIS-隧铁蛋白-TEV-肤。 在一些实施方案中，通过每一亚基与相邻亚基直接融合来产生融合蛋白。在某些实施方案 中，组合物在肤或蛋白质结构域和脂质运载蛋白之间还包含连接子序列。在一些实施方案 中，肤包含打结肤。
[0090] 在一些实施方案中，融合蛋白还包含I巧启动序列、sFLAG、HIS和TEV中的至少一 种。在某些实施方案中，融合蛋白包含W下构建体：I巧SP-S化AG-HIS-隧铁蛋白-TEV-肤。 在其它实施方案中，肤包含打结肤。
[0091] 在一些方面，所关注的蛋白质或肤与脂质运载蛋白的融合物可增强所关注的蛋白 质或肤在产生之后的纯化。例如，与脂质运载蛋白融合的所关注的蛋白质或肤可从蛋白质 表达系统（例如融合蛋白表达系统）产生。例如，如果所关注的蛋白质或肤没有与脂质运 载蛋白融合，那么所关注的蛋白质或肤可在产生期间保留于细胞区室中。
[0092] 在一些方面，SCN具有赋予融合伴侣的体内保护性质，W作为体内治疗性融合伴侣 的基础。在一些方面，可使运些治疗剂稳定W用作免疫原，从而使供给脂质运载蛋白序列的 物种匹配接受物种，W集中所引发的对融合伴侣的免疫反应。SCN还具有独特的配体特异性 并且紧密地结合铁载体价铁离子馨合剂）。
[0093] 本文所述的方法和组合物包括所关注的蛋白质或肤与SCN和SCN配体偶联成的融 合蛋白。在一些方面，SCN的配体可W包括但不限于铁载体或组织性金属。在一些方面，包 括SCN配体的融合蛋白可W与巧光团偶联。例如，偶联可W是共价偶联。在一些方面，包括 SCN配体的融合蛋白可W与发光铁载体偶联。在一些方面，发光铁载体可W包括金属络合 物。
[0094] 在一些方面，向融合蛋白添加SCN配体可用W检测或定位融合蛋白的祀标蛋白质 或祀标肤。例如，可体外或体内进行所述检测和定位。在一些方面，向融合蛋白添加SCN配 体可用W从混合物纯化融合蛋白。例如，可使SCN配体（例如铁载体/金属络合物）与至 少一种除包括但不限于侣、礼、铜、饥、坏或社和任何相关同位素W外的纯化树脂金属接触。
[0095] 在一些方面，向融合蛋白添加SCN配体可用于将放射性核素递送到祀标组织。在 一些方面，向融合蛋白添加SCN配体可用W将铁递送到祀标。另外，SCN结合于铁载体并且 铁可为深红色。例如，深红色可与纯化方法中的色谱或其它步骤的方法和组合物组合。
[0096] 在一个示例性方面，可則尋白裂解SCN同工型添加到所关注的肤或蛋白质中W产 生融合蛋白。例如，白裂解SCN同工型可化含有紧随CIDG氨基酸序列之后的RARYKR氨基 酸序列。在运种情况下，在输出融合蛋白期间，RARYKR序列可W通过内源酶裂解到蛋白质 表达系统的细胞（例如哺乳动物细胞）中。例如，弗林蛋白酶可W裂解RARYKR序列。在运 种情况下，SCN和所关注的肤或蛋白质可W是游离的并且位于