一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的 方法。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁多糖主要包括纤维素和半纤维素，它的来源丰富、可再生，是生产可再 生生物燃料的理想原料。将植物细胞壁多糖，尤其是其中的主要成分一一纤维素完全降解 为可发酵的简单寡糖和单糖如葡萄糖需要复杂的纤维素酶酶系协同作用。里氏木霉是一种 丝状真菌，具有强大的分泌纤维素酶的能力。工业上，经改造后的里氏木霉，其产纤维素酶 的产量可达到l〇〇g/L以上，因此，在降解植物细胞壁多糖以及相关应用上具有重要的应用 价值。
[0003] 里氏木霉的纤维素酶系包括两个外切纤维素酶、五个内切纤维素酶、一个葡 萄糖苷酶和三个裂解性多糖单加氧酶（lyticpolysaccharidesmonooxygenases,LPMOs， 即原GH61家族成员）。对这些纤维素酶的分泌表达的调控非常复杂，涉及到多个阶段，如转 录、翻译、转运、蛋白折叠、胞外降解等以及多种关键因子。
[0004] 里氏木霉的纤维素酶对纤维素的降解，主要采取的是水解的作用方式，具体为：外 切纤维素酶从纤维素链的还原端（CBH1)和非还原端（CBH2)进行切割，而内切纤维素酶则 从纤维素的无定形区进行切割，释放出来的自由末端可称为外切纤维素酶的底物；β-葡 萄糖苷酶将纤维二糖或纤维寡糖降解为葡萄糖。三种类型的纤维素酶协同作用，共同发挥 水解纤维素的作用。
[0005] 里氏木霉的纤维素酶中还包括微量的裂解性多糖单加氧酶，其中TrAA9A和 TrAA9B的性质得到了初步的阐明，采取氧化裂解的方式对纤维素发生降解作用。
[0006] 由于裂解性多糖单加氧酶采取了不同于普通纤维素酶一样的氧化裂解方式对纤 维素进行降解，其产生的纤维素链末端可称为外切纤维素酶的作用位点，而裂解性多糖单 加氧酶所产生的氧自由基因其分子小，可攻击高度结晶的纤维素分子，对这些位点的裂解 可打破高度结晶的纤维素结构，而产生无定形区，作为内切纤维素酶的作用位点。基于酶之 间的协同作用，过表达裂解性多糖单加氧酶有可能提高里氏木霉的纤维素酶酶活。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供过表达TrLPM09C的技术以快速提高里氏木霉产纤维素酶酶 活的方法。
[0008]本发明的再一目的是提供高产纤维素酶酶活的重组里氏木霉。
[0009] 根据本发明的快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法包括在里氏木霉中过表 达里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPM09C的步骤。
[0010] 根据本发明的快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法，其中，所述TrLPM09C基 因的序列如SEQIDNo. 1所示，以pRS424为模板，通过将cbhl启动子、TrLPM09C全长基因 片段以及cbhl终止子串联拼接而成的TrLPM09C基因的过表达质粒，cbhl启动子的序列如SEQIDNo. 2所示，cbhl终止子的序列如SEQIDNo. 3所示。
[0011] SEQIDNo. 1 ：
[0012] ATGAAGCTTTGGATCGGCCTCTTGCTTTTGGGCCTCGCCTGCAGGGCAAGTGCCCACACAACTTTCACC ACGCTCTTCATCGACAAGAAGAACCAAGGGGATGGGACGTGCGTCCGGATGCCGTACGATGACAAGACGGCAACCAA CCCGGTCAAACCCATCACATCTTCAGACATGGCTTGTGGTGAGCATGCTTCTCTTACCAGGGCCGCCCGAATGGCAG TGAAGCTGGTTCGGTATTGACATATATCATCAGGTCGCAACGGTGGCGATCCGGTGCCATTCATTTGTTCGGCAAAG AAAGGATCTTTGCTCACCTTTGAATTTCGCCTCTGGCCCGATGCTCAGCAGCCCGGTAGCATTGATCCTGGCCACCT GGGTCCCTGCGCCGTGTACCTGAAGAAGGTTGACAACATGTTCTCGGACAGCGCCGCCGGTGGCGGCTGGTTCAAGA TCTGGGAGGACGGCTACGACTCCAAGACGCAGAAATGGTGCGTCGACCGCCTTGTCAAGAACAATGGCCTGCTCTCC GTGAGGCTTCCCAGGGGACTGCCTGCGGGATACTACATCGTGAGGCCCGAGATCCTCGCGCTGCACTGGGCTGCCCA TCGCGACGACCCGCAGTTCTACCTCGGTTGCGCCCAAATCTTCGTCGACAGCGACGTACGTGGTCCGCTGGAGATTC CTCGGAGACAGCAAGCGACTATCCCTGGGTATGTCAACGCCAAGACCCCAGGCCTCACGTTCGACATCTACCAGGAC AAGCTGCCTCCGTATCCCATGCCCGGCCCCAAGGTGTATATCCCCCCCGCGAAGGGGAACAAGCCCAATCAGGACCT GAACGCGGGCCGGCTCGTCCAGACTGACGGCCTCATCCCCAAGGACTGCTTGATCAAGAAGGCAAACTGGTGCGGCA GGCCCGTCGAGCCGTACTCGAGCGCACGCATGTGCTGGAGGGCCGTCAACGACTGCTACGCGCAGAGCAAGAAGTGC AGGGAGAGCTCTCCGCCCATAGGGCTGACCAACTGCGACCGCTGGAGCGACCACTGCGGCAAGATGGACGCGCTTTG CGAGCAGGAAAAGTACAAGGGGCCGCCCAAGTTCACCGAGAAGGAGTACGTTGTGCCGGCGCCGGGGAAGCTGCCGG AGATGTGGAACGACATCTTTGAGCGGCTTGAGCAGAACGGAACTTCTACCAAGTTTTTTTGA
[0013] SEQIDNo. 2(cbhl启动子）：
[0014] GGGTTTGGAGCAATGTGGGACTTTGATGGTCATCAAACAAAGAACGAAGACGCCTCTTTTGCAAAGTTT TGTTTCGGCTACGGTGAAGAACTGGATACTTGTTGTGTCTTCTGTGTATTTTTGTGGCAACAAGAGGCCAGAGACAA TCTATTCAAACACCAAGCTTGCTCTTTTGAGCTACAAGAACCTGTGGGGTATATATCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAA TCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGA AAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTC CATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGC GATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGAC ATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCAC TATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGC TTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATC TGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAA GCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATAC CAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAAC GGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTG TTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTG ATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGT CTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGG CAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCG GGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGT TCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAA ACGGA