ATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCC CCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCG CGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT
[0015]SEQIDNo. 3(cbhl终止子）
[0016]AGCTCCGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGC TACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCAC TGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCT TAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTC ATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCACGGCAAAGGTATTTCATGATCGTTCAATGTTGATAT TGTTCCCGCCAGTATGGCTCCACCCCCATCTCCGCGAATCTCCTCTTCTCGAACGCGGTAGTGGCGCGCCAATTGGT AATGACCCATAGGGAGACAAACAGCATAATAGCAACAGTGGAAATTAGTGGCGCAATAATTGAGAACACAGTGAGAC CATAGCTGGCGGCCTGGAAAGCACTGTTGGAGACCAACTTGTCCGTTGCGAGGCCAACTTGCATTGCTGTCAAGACG ATGACAACGTAGCCGAGGACCGTCACAAGGGACGCAAAGTTGTCGCGGATGAGGTCTCCGTAGATGGCATAGCCGGC AATCCGAGAGTAGCCTCTCAACAGGTGGCCTTTTCGAAACCGGTAAACCTTGTTCAGACGTCCTAGCCGCAGCTCAC CGTACCAGTATCGAGGATTGACGGCAGAATAGCAGTGGCTCTCCAGGATTTGACTGGACAAAATCTTCCAGTATTCC CAGGTCACAGTGTCTGGCAGAAGTCCCTTCTCGCGTGCGAGTCGAAAGTCGCTATAGTGCGCAATGAGAGCACAGTA GGAGAATAGGAACCCGCGAGCACATTGTTCAATCTCCACATGAATTGGATGACTGCTGGGCAGAATGTGCTGCCTCC AAAATCCTGCGTCCAACAGATACTCTGGCAGGGGCTTCAGATGAATGCCTCTGGGCCCCCAGATAAGATGCAGCTCT GGATTCTCGGTTACGATGATATCGCGAGAGAGCACGAGTTGGTGATGGAGGGGACGAGGAGGCATAGGTCGGCCGCA GGCCCATAACCAGTCTTGCACAGCATTGATCTTCCTCACGAGGAGCTCCTGATGCAGAAACTCCTCCATGTTGCTGA TTGGGTTGAGAATTTCATCGCTCCTGGATCGTATGGTTGCTGGCAAGACCCTGCTTAACCGTGCCGTGTCATGGTCA TCTCTGGTGGCTTCGTCGCTGGCCTGTCTTTGCAATTCGACAGCAAATGGTGGAGATCTCTCTATCGTGACAGTCAT GGTAGCGATAGCTAGGTGTCGTTGCACGCACATAGGCCGAAATGCGAAGTGGAAAGAATTTCCCGGCGCGGAATGAA GTCTCGTCATTTTGTACTCGTACTCGACACCTCCACCGAAGTGTT根据本发明的【具体实施方式】，设计引 物，从里氏木霉TU-6的基因组DNA中扩增cbhl基因启动子片段、TrLPM09C全长基因片段 和cbhl终止子，同时用Kpnl、SacI将pRS424质粒载体进行双酶切，电泳回收这四个片段。 将这四个片段同时转化酿酒酵母AH109菌株，由于在引物设计时，加入了末端的互补序列， 因此PRS424和这三个外源片段可以通过酿酒酵母的体内重组无缝拼接起来。挑取筛选平 板上的阳性克隆，通过PCR及质粒测序的方法验证这三个外源片段的插入。经验证这三个 外源片段同时且正确拼接的质粒即为受cbhl启动子调控的、能过表达TrLPM09C的重组质 粒。将重组转化子接种于土豆培养基平板上产孢，将IX107孢子接种到100ml以葡萄糖作 为唯一碳源的MM-glucose培养基中，并于30°C，180rpm培养3天。将菌丝过滤、无菌水洗 涤并转移至l〇〇ml以微晶纤维素Avicel做唯一碳源的MM_Avicel培养基中，继续于30°C， 180rpm培养7天。
[0017] 本发明通过对里氏木霉的TrLPM09C基因进行过表达，获得了纤维素酶酶活显著 提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养7天后，其纤维素酶的滤纸酶活0. 21U/ml，CMC 酶活0. 40U/ml，较出发菌株均有一定程度的提高。
【附图说明】
[0018] 图1为PLPM09C质粒构建及其作用示意图。
[0019] 图2显示TrLPM09C在里氏木霉RUT-C30基因组的整合及表达鉴定，A:PCR检测 TrLPMO表达盒在里氏木霉基因组中的插入，1，DNA分子量标准；2,水对照；3,RUT-C30出发 菌株；4-13,转化子1-10。B:SDS-PAGE电泳检测重组TrLPMO的表达。1，蛋白质分子量标 准；2,RUT-C30出发菌株；3-7 :转化子1-5。
[0020] 图3显示RUT-C30和转化子（Transformant-Ι)的纤维素酶酶活比较.A:滤纸酶 酶活；B:外切酶CBHI酶活；C:CMC酶活；D:葡萄糖苷酶酶活。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1TrLPM09C基因进行过表达的重组质粒pLPM09C的构建
[0022] 通过构建PLPM09C重组质粒，转入里氏木霉中，在cbhl启动子的驱动下转录并合 成LPM09C蛋白分泌至胞外。pCrel-i的质粒构建示意图如图1所示。
[0023] cbhl启动子的扩增
[0024]以里氏木霉Tu-6 的基因组DNA为模板，以PcbhlpFl(5'-GCGTAATACGACTCACTATA GGGCGAATTGGCGGCCGCGGGTTTGGAGCAATGTGGGAC-3'）和PcbhlpRl(5,-CGGAGCTGGATCCGAATTC GTCGACCTCGAGGGTACCAGCACGAGCTGTGGCCAAGAAG-3'）为引物对cbhl基因启动子进行扩增。 PCR反应条件为：95°CX5分钟->94°CX0.5分钟，55°CX0.5分钟，，72°CX2分钟，35个 循环->72°CX10分钟_>结束反应。在1 %琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带， 纯化DNA。
[0025] TrLPM09C全长基闵片段的扩增
[0026]以里氏木霉Tu-6 的基因组DNA为模板，以PLPM09CF1 (5'-CGTCATCTCGGCCTTCTTGGC CACAGCTCGTGCTCACACAACTTTCACCACGCTCTTC-3'）和PLPM09CR1(5,-ATCTACCGGTGCGTCAGGCT TTCGCCACGGAGCTTCAAAAAAACTTGGTAGAAGTTCCG-3'）为引物对反向的TrLPM09C全长基因进 行扩增。PCR反应条件为：95°CX5分钟->94°CX0.5分钟，55°CX0.5分钟，，72°CX1.5 分钟，35个循环->72°CX10分钟_>结束反应。在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的 目的条带，纯化DNA。
[0027] cbhl终lh子片段的扩增
[0028]以里氏木霉Tu-6 的基因组DNA为模板，以PcbhltFl(5,-TCGTGCTGGTACCCTCGAGGTC GACGAATTCGGATCCAGCTCCGTGGCGAAAGCCTGAC-3'）和PcbhltRl(5,-ATTAACCCTCACTAAAGGGAA CAAAAGCTGGCGGCCGCAACACTTCGGTGGAGGTGTCG-3'）为引物对正向的cbhl终止子进行扩增。 PCR反应条件为：95°CX5分钟->94°CX0.5分钟，55°CX0.5分钟，，72°CXI分钟，35个 循环->72°CX10分钟_>结束反应。在1 %琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带， 纯化DNA。
[0029]DLPM09C质粒的构律
[0030] 将pRS424质粒用KpnI、SacI双酶切，电泳、回收线性化质粒载体。将其和cbhl启 动子、LPM09C基因、cbhl终止子DNA片段按1:3:3:3的摩尔比用氯化锂法共同转化酿酒酵 母AH109的感受态细胞，涂布在SD-Trp培养基上，30°C静置培养48h。对酵母菌落做菌落 PCR，以鉴定三个片段是否已经连接到pRS424上。将PCR鉴定为阳性的酵母菌落挑取并接 种于3mlYH)培养基上，30°C、180rpm振摇培养过夜，提取质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transl-Tl感受态细胞，涂布于含100μg/ml氨苄的LB琼脂平板上，37°C静置培