养16h。挑 取单克隆菌落，接种于3mlLB培养基（含100yg/ml氨节）中，37°C、180rpm振摇培养过 夜，提取质粒，备用于转化。
[0031] 实施例2pLPM09C转化入里氏木霉
[0032] 含潮霍素抗件基_hph的pRLMex30质粒的准备
[0033] pRLMex30质粒含有潮霉素抗性基因hph，该抗性基因可在里氏木霉的pki组成 型启动子和cbhl终止子的调控下进行组成型的表达。将pRLMex30质粒转化大肠杆菌 Transl-Tl感受态细胞，涂布于含100μg/ml氨苄的LB琼脂平板上，37°C静置培养16h。挑 取单克隆菌落，接种于311111^培养基（含100以8/1111氨节）中，37<€、180印1]1振摇培养过 夜，提取质粒，备用于转化。
[0034] 単氏太霍RUT-C30的转化
[0035] 将里氏木霉RUT-C30接种于土豆培养基（PDA)平板上，30°C静置培养7d待其产 孢，将孢子刮下并接种于l〇〇mlPDB培养基中，30°C、180rpm振摇培养过夜。在12层纱布 上过滤收集萌发的菌丝，加入l〇mg/ml的Lysingenzymes(购自Sigma公司），在30°C消化 1-2小时。收集原生质体，将pLPM09C质粒和pRLMex30质粒DNA(各5μg)混合，以PEG介 导的原生质体转化法将两种DNA同时转入里氏木霉RUT-C30菌株。
[0036] 实施例3重组转化子的筛选
[0037] 转化子在含1M山梨醇和300μg/ml的MM-glucose琼脂培养基上生长、选择。挑 取单个克隆于MM-glucose琼脂培养基上生长。提取基因组DNA，通过PCR验证pLPM09C质 粒已经成功转化进入里氏木霉细胞。PCR所用引物为：PLPM09CD_f(5'-GCTCTCCCCATCTACTC ATCAACTC-3' ）和PLPM09CD_r(5' -GCTGCTGAGCATCGGGCCAGAGGCG-3' ）。
[0038] 在1%琼脂糖胶上电泳，有10个转化子出现和预期一致大小的DNA条带（如图2 所示）。因此，这些转化子是有PLPM09C质粒转入的阳性转化子。将这些转化子接种于PDA 培养基上，30°C静置培养7d产孢，收集孢子备用。
[0039] 实施例4.转化子的诱导培养和纤维素酶活测定
[0040] 转化子的诱导培养
[0041] 经预实验证明，第1号转化子（Transformant-Ι)的纤维素酶酶活提高最为显著。 因此，将出发菌株RUT-C30的孢子和转化子Transformant-Ι的孢子，分别接种IX107于 100mlMM-glucose培养基中。30°C、180rpm振摇培养3d。将菌丝用12层纱布过滤，收集菌 丝并用大量无菌水冲洗，以去除残余的葡萄糖。
[0042] 称取等量（200mg)的菌丝，接种于100mlMM-Avicel液体培养基中，出发菌株和每 个转化子均做3个平行。30°C、18〇rpm振摇培养7d以诱导纤维素酶的生产。从第3d开始， 每12小时收集发酵液，储存于4°C冰箱备用。
[0043] 纤维素酶活测宙
[0044] 对出发菌株RUT-C30和转化子Transformant-Ι，分别测定每个时间点取出的发 酵液中总体纤维素酶酶活（滤纸酶酶活）及各分解酶酶活包括内切纤维素酶酶活（CMC酶 活）、外切纤维素酶酶活（CBH酶活）以及β-葡萄糖苷酶酶活（BG酶活）。
[0045] 纤维素酶滤纸酶活的测定：纤维素酶的滤纸酶活（FPaseactivity)采用Whatman 一号滤纸，参照IUPAC标准方法进行测定。将Whatman1号滤纸制成1. 5cm长、lcm宽的形状 (l〇mg左右），折成4折，成Μ型。将滤纸条置于试管底部，加入醋酸一醋酸钠缓冲液（0.2M、 口!15.0)35(^1，抗坏血酸（2001111)5以1，铜离子（12.51111)2(^1。50°(：水浴平衡后，加入酶 液125μ1(空白先不加），混合均匀，使管内溶液浸没滤纸。50°C水浴保温1小时。向各试 管中加入750μ1DNS试剂，再向空白中补加酶液125μ1，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速 冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。lml液体酶，在50°C、pH5. 0的条件下，从 葡萄糖标准曲线求得葡萄糖含量，计算酶活力单位。以每分钟产生相当于1μπιο?葡萄糖的 酶量定义为一个酶活力单位（U)。酶活测定结果见图3Α。
[0046]外切纤维素酶活的测定：用 4-methylumbelliferyl-D-cellobioside(MUC,Si gma)作底物，称取30mgMUC，溶于3mlDMSO(Sigma)，再将其转移到27ml柠檬酸缓冲液 (ρΗ5· 0,50mM)中。将25μ1酶液和200μ1MUC、25ul葡萄糖（1M)混合，此为不加纤维二 糖实验组。在混合溶液中，葡萄糖会抑制BG降解MUC，因此，测得的活性实际为CBH1和EG 的活性。同时设加纤维二糖实验组：25μ1酶液、200μ1MUC、25ul葡萄糖（1M)和纤维二糖 (50mM)于50°C反应30min。加入纤维二糖会抑制CBH的活性，因此测得的是EG的活性。加 入250μ1Na2C03(lM)。吸取200μ1于370nm测定吸光度。将不加纤维二糖实验组0D值 减去加纤维二糖实验组，即为外切纤维素酶较为特异的活性。一单位的外切纤维素酶酶活 定义为每秒催化lnmolMUC水解所需要的酶量。酶活测定结果见图3B。
[0047] 内切纤维素酶酶活测定：采用羧甲基纤维素钠（CMC)作为底物进行测定。取lg 羧甲基纤维素钠，双蒸水定容至50ml，得到2%的羧甲基纤维素钠溶液。在2mlEP管中加 入2%的羧甲基纤维素钠溶液30μ1、醋酸一醋酸钠缓冲液（0. 2M、pH5. 0) 35μ1、抗坏血酸 (40mM) 5μ1，Cu2+(5mM) 10μ1，50°C水浴平衡后，加入酶液20μ1 (空白先不加），振荡混合均 匀。50°C水浴保温1小时。向各ΕΡ管中加入，150μ1DNS试剂，再向空白中加酶液20μ1， 混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。在50°C、 pH5. 0的条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠，产生1μmol还原糖（以葡萄糖计）所需要 的酶量定义为一个酶活力单位（U)。酶活测定结果见图3C。
[0048]β-葡萄糖苷酶酶活的测定：采用pNPG为底物进行测定。称取4. 8mgpNPG溶于 4mlddH20中，即为4mM底物。在2mlEP管中加入4mMpNPG25μ1，醋酸一醋酸钠缓冲液 (0.21、？!15.0)4(^1、抗坏血酸（401111)5 4 1，（：112+(51111)1(^1。50°(：水浴平衡后，加入酶 液20μ1(空白先不加），振荡混合均匀。50°C水浴保温2小时。向各ΕΡ中加入300μ1 Na2C03(lM)，再向空白中加酶液20μ1，混合均匀。吸取200μ1于370nm测定吸光度。在 50°C、pH5. 0的条件下，每分钟水解pNPG，产生1μmol还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶 量定义为一个酶活力单位（U)。酶活测定结果见图3D。
[0049] 通过对里氏木霉的ΤρΛΠΜ09X基因进行过表达，获得了纤维素酶酶活显著 提高的转化子。转化子在MM-Α?ΟΓ/ελ中培养7天后，其纤维素酶的滤纸酶活0. 21Υ/μλ， XΜX酶活〇.40Υ/μλ，较出发菌株均有一定程度的提高。
【主权项】
1. 一种快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法，其特征在于，所述方法包括在里氏 木霉中过表达里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPM09C基因的步骤。2. 根据权利要求1所述的快速提高里氏木霉产纤维素酶酶活的方法，其特征在于，以 PRS424为骨架质粒，依次连接核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的cbhl启动子、核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示的TrLPM09C基因和核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的cbhl终止子的 片段，构建TrLPM09C基因的过表达质粒。3. 高产纤维素酶酶活的重组里氏木霉，其特征在于，在里氏木霉中过表达里氏木霉裂 解性多糖单加氧酶9C基因TrLPM09C基因。4. 根据权利要求3所述的高产纤维素酶酶活的重组里氏木霉，其特征在于，所述重 组里氏木霉包含里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPM09C基因的过表达质粒，以 PRS424为骨架质粒，依次连接核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的cbhl启动子、核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示的TrLPM09C基因和核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的cbhl终止子的 片段，构建TrLPM09C基因的过表达质粒。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。所述方法包括在里氏木霉中过表达里氏木霉裂解性多糖单加氧酶9C基因TrLPMO9C基因的步骤。本发明通过对里氏木霉的TrLPMO9C基因进行过表达，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养7天后，其纤维素酶的滤纸酶活0.21U/ml，CMC酶活0.40U/ml，较出发菌株均有一定程度的提高。
【IPC分类】C12R1/885, C12N15/80, C12N1/15
【公开号】CN105238704
【申请号】CN201510795456
【发明人】姚斌, 苏小运, 宫莉, 薛鲜丽, 罗会颖, 王亚茹, 黄火清, 柏映国, 王苑
【申请人】中国农业科学院饲料研究所
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月18日