调节植物中的种子和器官大小的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及改变植物的种子和器官的大小，例如W便提高植物产量的方法。
【背景技术】
[0002] 种子和器官的大小是在遗传控制下的农艺学上和生态学上重要的性状(Alonso-Bianco, C.PNAS USA 96,4710-7(1999) ;Song，X.J. 化 t Genet 39,623-30(2007);Weiss, J.Int J Dev Biol 49,513-25(2005)；Dinneny,J.R.Development 131,1101-10(2004)； Disch,S.Curr Biol 16,272-9(2006)!Science 289,85-8(2000);Ho;riguchi,G.Plant J 43,68-78(2005);Hu，Y Plant J 47，l-9(2006);Hu，Y.Plant Cell 15,1951-61(2003); Krizek，B.A.Dev Genet 25,224-36(1999);Miz址ami,Y.PNAS USA 97,942-7(2000);化th, U.Science 299,1404-7(2003)；0hno,C.K.Development 131,1111-22(2004)；Szecsi, J.Embo J 25,3912-20(2006)；White,D.W.PNAS USA 103,13238-43(2006)；Horvath, B.M.Embo J 25,4909-20(2006);Garcia，D.Plant Cell 17,52-60(2005)。种子和器官的最 终大小在给定物种内是恒定的，而物种间种子和器官大小变化非常大，运表明植物具有W 协调且及时的方式控制种子和器官生长的调控机制。然而，尽管种子和器官大小的重要性， 关于控制植物中的最终器官和种子大小的分子和遗传机制的所知甚少。
[0003] 已经使用数量性状基因座(Q化)定位在植物中包括在西红柿、大豆、玉米W及水稻 中对种子大小的遗传调控进行了研究。迄今为止，在公开的文献中，已经鉴别了两种基因 (Song ,X. J.化t Genet 39,623-30(2007);化11, C. !"Iieor .Appl. Genet. 112,1164-1171 (2006))，运两种基因是水稻粒度的潜在的两种主要QTL但是运些基因的分子机制仍有待 阐明。在拟南芥中，已经对影响种质(accessiorOLer和Cvi之间的杂交中的种子重量和/或 长度的^^一种基因座进行了定位{Alonso-Bianco, 1999同上}，但是尚未鉴别相应基因。最 近研究已经掲示AP2和ARF2参与控制种子大小。然而，不幸的是，ap2和arf2突变体具有比野 生型更低的能育性（Schruff,M.C.Development 137,251-261(2006);0hto，M.A.PNAS USA 102，3123-3128(2005);化fuku，K.D.PNAS USA 102,3117-3122(2005))。此外，使用突变植 物的研究已经鉴别了通过对细胞增殖或膨大起作用而影响器官大小的几种正和负调控因 子化rizek'B.A.Dev Genet 25,224-36(1999) ;Mizukami,Y.Proc Natl Acad Sci U S A 97,942-7(2000);化th，U.Science 299,1404-7(2003);0hno，C.K.Development 131,1111-22(2004)；SzecsiJ.Embo J 25,3912-20(2006)；White ,D.W.PNAS USA 103,13238-43 (2006);Horvath,B.M.Embo J25,4909-20(2006);Garcia，D.Plant Cell 17,52-60(2005)。 Horiguchi,G.Plant J 43,68-78(2005)；Hu,Y Plant J 47,1-9(2006)Dinneny, J.R.Development 131,1101-10(2004))。
[0004] 设及泛素相关活性的几种因子已知影响种子大小。生长限制因子DAl是泛素受体 并且包括在体外结合泛素的两个泛素相互作用基序化IM)，并且dal-1突变体通过影响胚珠 的母体珠被而形成大种子化i等人，2008) "dal-l的一个增强子化ODlK其编码E3泛素连接 酶BIG BROT肥R(BB) (Disch等人，2006;Li等人，2008)中的突变协同增强dal-1的种子大小 表型，从而指示DAl与EODl/BB协同作用来控制种子大小。在水稻中，粒宽和粒重2(GW2)的编 码E3泛素连接酶的数量性状基因座(Q化)通过限制细胞分裂来控制粒度(Song等人，2007)。 已经鉴别了小麦中的GW2同源物(Ta-GW2; Be化arek等人2012)。需要由水稻qSW5/GW5编码的 未知蛋白质来限制水稻中的粒度(Shomura等人，2008 ;Weng等人，2008) eGW5在酵母双杂交 测定中与聚泛素物理地相互作用，从而表明GW5可能参与泛素-蛋白酶体途径(Weng等人， 2008)。然而，尚不清楚运两种因子是否在水稻中的母体组织和/或合子组织中起作用。
[0005] 鉴别控制种子和器官两者的最终大小的其他因子将不仅增进对植物中的大小控 制的机制的了解，而且可W例如在提高作物产量和用于产生生物燃料的植物生物质方面具 有大量的实际应用。
【发明内容】
[0006] 本发明人已经鉴别了植物E3泛素连接酶(被称为DA2)，其通过限制发育种子的珠 被中的细胞增殖来调控种子和器官的最终大小。出人意料地发现DA2与DAl协同作用且独立 于EODl来控制种子和器官大小。WDA2和DAl和/或EODl为目标因此可用于提高植物产量。
[0007] 本发明的一方面提供了一种增加植物的产量的方法，包括：
[0008] 降低所述植物的细胞内的DA2多肤的表达或活性，
[0009] 其中所述植物缺乏DAl表达或活性。
[0010] 本发明的另一方面提供了一种增加植物的产量的方法，包括：
[0011] 降低所述植物的细胞内的DA2多肤的表达或活性，
[0012] 其中所述植物缺乏EODl表达或活性。
[0013] 本发明的另一方面提供了一种增加植物的产量的方法，包括：
[0014] 降低所述植物的细胞内的DA2多肤的表达或活性，
[0015] 其中所述植物缺乏DAl和EODl表达或活性。
[0016] 本发明的另一方面提供了一种增加植物的产量的方法，包括：
[0017]降低或消除所述植物的细胞内的DA2多肤的表达或活性，W及；
[0018] i)降低或消除所述细胞内的DAl多肤的表达或活性，
[0019] i i)降低或消除所述细胞内的EODl的表达或活性，和/或
[0020] i i i)在所述细胞内表达显性阴性的DA多肤。
[0021] 本发明的另一方面提供了一种产生具有增加的产量的植物的方法，包括：
[0022] 提供缺乏DAl、E0D1或DAl和EODl两者的表达或活性的植物细胞，
[0023] 通过转化将消除或抑制DA2多肤的表达或活性的异源核酸并入所述植物细胞中， W及；
[0024] 从一个或多个转化的细胞再生所述植物。
【附图说明】
[00巧]图1示出da2-l突变体中的种子和器官大小。IA示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1种 子的投影面积。将种子分成=组(〉〇. 13、0.12-0.13和<0.12mm2)。将每组的值表示为所分析 的总种子数目的百分比。IB示出Col-0、da2-l和35S::DA2#1的每角果种子数目。主茎上的角 果(从第四角果至第十角果）用于测量每角果种子数目。IC示出Co^0、da2-1和35S: :DA2#1 的每植株种子重量。ID示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1的每植株种子数目。化示出Col-0、 da2-l和35S: :DA2#1植株的高度。数值(B-E)作为相对于野生型数值的平均值±SE给出，设 置成100%。相较于野生型，**，P<0.01和*，P<0.05(学生t检验）。尺条:F，lcm;G，lmm
[0026] 图2示出Col-O(左）、da2-l(中间）和35S: :DA2#1(右）的4天龄植株（F)和Col-O (上）、da2-l(中间）和35S: :DA2#1(下）的花(G)。
[0027] 图3示出DAl和DA2协同作用来控制种子大小。3A示出Col-0、dal-l、da2-dPdal-l da2-l的干种子。3B示出C〇]_-0、da2-l、dal-l和dal-1 da2-l(从左至右）的10天龄幼苗。3C示 出(：〇^0、(1曰1-1、(1曰2-1和(1曰1-1(1曰2-1的种子重量。30示出(：〇1-0、(1曰1-1?)1、(1曰2-巧0(1曰1-1?)1 da2-l的种子重量。数值作为相对于对应野生型数值的平均值±56给出，设置成100%。相较 于野生型，**，P<0.01 和*，P<〇.〇5(学生 t 检验）。尺条:A，0.1mm;B，lm
[002引图4示出DAl和DA2协同作用来控制种子大小。左上图示出10天龄Col-O、dal-l、 da2-l和dal-1 da2-l幼苗的子叶面积。右上图示出10天龄Co^0、dal-kol、da2-dPdal-kol da2-l幼苗的子叶面积。左下图示出仿^0、(1曰1-1、(1曰2-巧日(1曰1-1(1曰2-1胚芽的子叶中的栅栏 细胞的平均面积。右下图示出Col-0、dal-l、dal-l da2-l、dal-kol da2-l、dal-kol darl-l 和dal-kol darl-1 da2-l种子的投影面积。数值作为相对于对应野生型数值的平均值±56 给出，设置成100%。相较于野生型，**，P<0.0l和*，P<0.05(学生t检验）。尺条:A，0.1mm;B， Im
[0029] 图5示出DAl和DA2协同作用来控制发育种子的母体珠被中的细胞增殖。（5A-5D)分 别示出(：〇^0、(1曰1-1、(1曰2-1和(1曰1-1(1曰2-1的成熟胚珠。(1曰2-1突变协同增强(1曰1-1的胚珠大 小。
[0030] 图6示出（左图）Col-0XCol-0(c/c)Fl、da2-lXda2-l(d2/d2)Fl、Col-0Xda2-l (c/d2)FlW及da2-lXCoレ0(d2/c)F巧中子的投影面积和（中间图）Col-0XCoレ0(c/c)Fl、 dal-kol da2-lXdal-kol da2-l(dd/dd)Fl、Col-〇Xdal-kol da2-l(c/dd)Fl、dal-kol da2-lXCol-0(dd/c)Fl种子的投影面积。右图示出在用dal-kol da2-l双突变体花粉对 (1曰1-4〇1/+(1曰2-1/+植物授粉，从而导致(1曰1-1?)1/+(1曰2-1/+种皮内的(1曰1-1?)1/+(1曰2-1/+(曰）、 dal-kol/+da2-lda2-l (b)、dal-kol/dal-kol da2-l/+(c) W及dal-kol da2-l(d)胚芽的发 育之后的投影种子面积。测量了来自用dal-kol da2-l双突变体花粉受精的dal-kol/+da2-IA植株的单个种子的投影面积。将运些种子针对dal-kol和da2-l突变进一步基因分型。数 据显示dal-kol和da2-l突变与运些种子的大小的变化不相关(P〉0.05,学生t检验）。数值作 为相对于对应野生型数值的平均值± SE给出，设置成100 %。相较于野生型，**，P<0.01 (学 生t检验）。尺条:A-D，0.5mm。
[0031 ] 图7不出（左图）〔〇1-〇、(1曰1-1、(1曰2-1和(1曰1-1(1曰2-1成熟胚珠的投影面积；（中间 图）在抓AP和8DAP时防^0、(1曰1-1、(1曰2-巧日(1曰1-1(1曰2-1种子的外珠被中的细胞的数目；^ 及化图）从单个种子的外珠被长度和细胞数目计算在抓AP和8DA邮tCo^0、dal-l、da2-l和 dal-1 da2-l种子的外珠被中的细胞的平均长度。
[0032] 图8A示出DA2基因结构。指示了起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。闭合框指示 编码序列，开放框指示5'和3'非翻译区，并且框之间的线指示内含子。示出DA2基因中的T-DNA插入位点(da2-l)。图8B示出DA2蛋白质包括预测的RING结构域。
[0033] 图9示出DA2的E3泛素连接酶活性。将MBP-DA2和突变的DA2(MBP-DA2C59S和MBP- DA2N91L)融合蛋白针对在E1、E2和化S-泛素化is-Ub)存在下的E3泛素连接酶活性进行测 定。分别通过用抗-Hi S抗体(抗-Hi S)和抗-MBP抗体(抗-MBP)免疫印迹（IB)来检测泛素化蛋 白质。下部箭头指示MBP-DA2蛋白质，并且上部箭头示出泛素化MBP-DA2蛋白质。
[0034] 图10示出(：〇^0、(1曰2-1、011#6、0^#8^及0^#10种子的投影面积（上图），其中0^ 是由其自己的启动子驱动的用DA2编码序列转化的da2-l;Col-0、da2-l、C0M#6、C0M#8和 COM# 10植株的花瓣面积（中间图）W及Co 1-0、da2-1、C0M#6、C0M#8 W及COM# 10幼苗中的DA2 基因表达的定量实时RT-PCR分析（下图）。数值(D和E)作为相对于da2-l数值的平均值± SE 给出，设置成100%。相较于da2-l突变体，**，P<0.0 l (学生t检验）。
[0035] 图11示出DA2的表达模式。IlA示出DA2基因表达的定量实时RT-PCR分析。从根(R)、 茎(S)、叶化）、幼苗(Se)W及花序（In)分离总RNA。llB-llN示出通过pDA2:GUS转基因表达监 巧化勺DA2表达活性。观察到四个GUS表达系，并且全部显示类似的模式，尽管它们在染色的强 度方面略有不同。4天龄幼苗（IlB)、10天龄幼苗（IlC)、花的花序（IlD)、正发育的花瓣（11E-11G)、正发育的雄蕊（11H和111)、正发育的屯、皮（IlJ-IlL)W及正发育的胚珠（11M和11N)中 的GUS活性的组织化学分析。尺条:B-D，Imm; E-N，0.1 mm。
[0036] 图 12 示出 DAl 在体外直接与 DA2 相互作用。将651'-041、651'-0411?3581(、651'-0八1-UIM、GST-DA1-LIM、GST-DA1-LIM+C和GST-DAl-C通过固定在直链淀粉树脂上的MBP-DA2拉下 来(PD)并且使用抗GST抗体通过免疫印迹(IB)进行分析。
[0037] 图13示出含有特异性蛋白质结构域的DAl及其衍生物的示意图。预测的DAl蛋白质 包括两个UIM基序，单个LIM结构域和C末端区域。
[003引图14示出DAl在体内与DA2相互作用。将本氏烟草（Nicotiana benthamiana)叶通 过注射拥有35S = Myc-DAl和35S:GFP-DA2质粒的根癌±壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)GV3101细胞进行转化。将总蛋白质用GFP-Trap-A免疫沉淀，并且分别用抗GFP 抗体和抗Myc抗体探测免疫印迹。在免疫沉淀的GFP-DA2复合物中检测到Myc-DAl，从而指示 在植株中在DAl与DA2之间存在物理相关性。
[0039] 图15示出da2-l突变体展示增加的器官大小。15A示出Co^0、da2-1 W及35S: DA2#1 植株的花瓣长度(PL)、花瓣宽度(PW)、花瓣面积(PA)、專片面积(SA)、屯、皮长度(CL)、长雄蕊 长度化化）W及短雄蕊长度（S化）。158示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1植株的第五叶面积。 15C示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1花的重量。1抓示出Col-O和da2-l花瓣的最大宽度区域 中的近轴表皮细胞的大小。15E示出Co 和da2-l的第五叶中的栅栏细胞的大小。开放的花 (阶段14)用于测量花瓣的大小（15A)、花的重量(C)和表皮细胞的大小（15D)。数值(A-E)作 为相对于对应野生型数值的平均值± SE给出，设置成100 %。相较于野生型，**，P<0.01 (学 生t检验）。
[0040] 图16示出DAl和DA2协同作用来控制种子大小。1抓示出Col-0、dal-kol、da2-l和 dal-kol da2-l花的花瓣面积。16E示出(：〇1-0、(1曰1-1?)1、(1曰2-1和(1曰1-1?)1(1曰2-1花瓣的最大 宽度区域中的近轴表皮细胞的大小。16F示出防^0、6〇(11-2、(1曰2-1和6〇(11-2(1曰2-1的种子重 量。16G示出防^0、6〇(11-2、(1曰2-1和6〇(11-2(1曰2-1的花瓣面积。开放的花(阶段14)用于测量 花瓣的大小（16D和16G)和表皮细胞的大小（16E)。值（16D-G)作为相对于对应野生型数值的 平均值±SE给出，设置成100%。相较于野生型，**，P<0.01和*，P<0.05(学生t检验）。尺条： 0.lmm〇
[0041 ] 图17示出DA2的过度表达限制器官生长。17A示出Co^O、35S: DA2#2和35S: DA2#4的 花瓣面积。17B示出(：〇1-0、355:042#2和358:042#4幼苗中的歴2的表达水平。值(4和8)作为 相对于Co值的平均值± SE给出，设置成100 %。相较于野生型，**，P<0.01 (学生t检验）。
[0042] 图18示出DA化的过度表达限制器官生长。18A示出Co^O、35S: DA2L#1、35S: DA^# 3、35S: DA2LM、35S: DA化#5 和 35S: DA 化#6 的 20 天龄植株。18B 示出 Co 、35S: DA 化# 1、35S: DA化#3、35S: DA化#4、35S: DA化#5 和 35S: DA化#6 的 30 天龄植株。18C示出 Co^O、35S: DA化#1、 35S: DA化#3、35S: DA化#4、35S: DA化#5和35S: DA化#6幼苗中的DA化表达的RT-PCR分析。对从 2周龄幼苗制备的第一链CDNA进行RT-PCR。将CDNA通过参考ACTIN2标准标准化。尺条:A， 1cm，B，1cm
[0043] 图19示出GW2的过度表达限制种子和器官生长。19A示出Col-0、35S:GW2#l、35S: 0胖2#2、355:6￥2#3、355:6胖2#6和355:6胖化#7的30天龄植株。198示出(：〇^0、355:6胖2#1、355: GW2#2、35S: GW2#3、35S: GW2#6 和 35S: GW 化 #7 种子的投影面积。19C 示出 Col-O、35S: GW2#1、 35S: GW2#2、35S: GW2#3、35S: GW2#6 和 35S: GW 化 #7 幼苗中的 GW2 基因表达的定量实时 RT-PCR 分析。数值(B)作为相对于Col-O数值的平均值±SE给出，设置成100%。相较于野生型，**，P <0.01(学生t检验）。尺条:A，lcm
【具体实施方式】
[0044] 本发明设及通过改变植物E3泛素连接酶DA2的表达或活性结合改变DA巧日/或EODl 的表达或活性来改变影响产量的植物性状(如种子和器官大小）的方法。优选地，在植物中 改变DA2和DAl的表达或活性。
[0045] 可在改变DAl和/或EODl的表达或活性之前、同时或之后改变DA2的表达或活性。例 如，在一些实施例中，可在一个或多个植物细胞中改变DA2多肤的表达或活性，所述植物细 胞已经具有W下之一:改变的DAl表达或活性、改变的EODl表达或活性、或改变的DAl和EODl 表达或活性。
[0046] 本文提供例如通过增加器官或种子大小来增加植物的产量的方法，所述方法包括 提供缺乏DAl和/或EODl表达或活性的植物，并且降低所述植物的一个或多个细胞中的DA2 的表达。在其他实施例中，可降低一个或多个植物细胞中的DAl和/或EODl的表达或活性，所 述植物细胞具有降低的DA2多肤表达或活性。
[0047] 其他方法可包括降低植物的一个或多个细胞中的DA2的表达并且降低一个或多个 细胞中的DAl、E0D1或DAl和EODl两者的表达或活性。
[004引本文还提供产生相对于野生型植物具有增加的产量的植物的方法，包括：
[0049] (a)通过转化将W下各项并入植物细胞中：
[0050] (i)第一异源核酸，所述核酸降低DA2多肤的表达，
[0051] (ii)第二异源核酸，所述核酸降低DAl多肤和EODl多肤之一的表达，W及任选地，
[0052] (iii)第S异源核酸，所述核酸降低DAl多肤和EODl多肤中的另一者的表达，W及
[0053] (b)从一个或多个转化的细胞再生所述植物。
[0054] 产生具有增加的产量的植物的其他方法可包括：
[0055] 提供缺乏DAl和/或EODl表达或活性、优选DAl活性的植物细胞，
[0056] 通过转化将降低DA2多肤的活性或表达的异源核酸并入所述植物细胞中，W及；
[0057] 从所述转化的细胞再生所述植物。
[0058] 在再生之后，可选择相对于野生型植物具有降低的DA2多肤活性或表达W及降低 的DAl和/或EODl活性或表达的植物。
[0059] 降低的DA2表达与降低的DAl和/或EODl表达的结合协同增加植物的种子和/或器 官的大小，从而增加植物产量。
[0060] 植物中的一种或多种与产量相关的性状可通过降低的DA2表达或活性结合降低的 DA巧日/或EOD1表达或活性来改进。例如，可相对于DA2多肤的表达尚未降低的对照或野生型 植物增加植物的寿命、器官大小和种子大小中的一者或多者。
[0061 ] DA2、DA1或EODl的表达或活性可在本文描述的方法中相对于野生型植物降低至少 50%、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %。在一些优选的实施 例中，表达或活性被降低至零或基本上为零(即表达或活性被消除）。
[0062] 本发明的方法包括改变植物的一个或多个细胞中的DA2多肤的表达或活性。
[0063] DA2多肤是在植物中发现的E3泛素连接酶。如本文所述的表达或活性被降低的DA2 多肤可包括RING结构域（Stone，S丄.等人（2005))，优选地为C5HC2、C5NC2或C5TC2RING结 构域。适合的RING结构域可由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成；
[0064] C(X)2C(X)iiCC(X)4CX2CX7化/N/T巧6C拉Ce(SEQ ID N0:1)
[0065] 例如，适合的RING结构域可由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；
[0066] CPICFL(Y/F)YP化NRS 化/R)CC(S/M/T/A 化(G/S)ICTEC化（Q/R)MK(P/N/S/V/T/N) (T/P)(H/N/T)(T/S)(A/T/C)(R/Q/K)PTQCP(F/Y)C
[0067] (沈Q ID NO:2)
[006引在一些实施例中，SEQ ID NO: 2的RING结构域中的位置33处的H/N/T残基可W是T 或N。
[0069] 在一些优选的实施例中，DA2多肤可包括RING结构域，所述RING结构域具有表1中 所示的氨基酸序列（SEQ ID N0:3-19)，例如拟南芥DA2(SEQ ID N0:11)、拟南芥DAL2(SEQ ID NO: 13)或水稻GW2(SEQ ID N0:7)或其变体。例如，RING结构域可具有W下各项的氨基酸 序列：SEQ ID N0:20(Pt_GI-224061326.pro)的残基 59 至 IOUSEQ ID N0:21(Rc_GI-255578534.口'〇)的残基59至101、沈9 10顯：22(￥￥_61-147817790.口'〇)的残基59至101、 SEQ ID N0:23(Gm_GI-35