N0:81(Rc_GI-255582236.9'〇)的残基187至229、沈9 10^:82。1_61-224059640.9'〇)的残基150至192、 SEQ ID N0:83(Gm_GI-356548935.pro)的残基 194 至 236、SEQ ID N0:84(Gm_GI-356544176.9'〇)的残基194至236、沈9 10側:85(￥￥_61-359487286.9'〇)的残基194至236、 SEQ ID N0:86(Tc_GI-508704801.pro)的残基 189 至 231、SEQ ID N0:87(Pp_GI-462414664.pro)的残基 192至234、沈Q ID NO:88(Cr_GI-482561003.pro)的残基 190至232、 SEQ ID N0:89(At_GI-22331928.pro)的残基 195至237或沈Q ID N0:90的残基 195至237 (S1_GI-460370551 .pro)，如表4中所示。
[0151] 其他适合的EOD结构域序列可使用如本文所述的标准序列分析技术(例如，简单模 块构造研究工具(SMART);EMBL化ide化e巧，DE)来鉴别。
[0152] 如本文所述的表达或活性被降低的EODl多肤可包括如表4中所列出的SEQ ID NO 74至90中的任一个的氨基酸序列。在一些优选的实施例中，EODl多肤可包括SEQ ID N0:89 (A巧ODl)或SEQ ID NO: 77或78(OsEODl)的氨基酸序列或可W是此序列的变体，其保留E3泛 素连接酶活性。
[0153] 为SEQ ID N0:74至90中的任一个或其他参考EODl序列的变体的EODl多肤可包括 与所述参考EODl序列具有至少20%、至少30%、至少40 %、至少50%、至少60%、至少70%、 至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %序列同一性的氨基酸序列。
[0154] 为SEQ ID N0:74至90中的任一个的变体的EOD多肤还可包括具有SEQ ID N0:73的 序列的EOD结构域。适合的序列的实例如上所列出。
[0155] 编码EODl多肤的核酸可包括选自由W下各项组成的组的数据库条目中列出的核 巧酸序列：XM_002299911. IGI: 224059639 (PtEODl) ;XM_002531864. IGI: 255582235 (RcEODl)；XM_002279758.261:359487285(VvEODl)；XM_003542806.161:356548934 (GmEODla)；XM_003540482.IGI:356544175(GmE0Dlb)；XM_002468372.IGI:242042044 (SbEODl);匪_001147247. IGI :226496788 (ZmEODl);或NP_001030922. IGI :79316205 (AtE0Dl;A口 g63530)，或可W是运些序列中的一个的变体。
[0156] 在一些优选的实施例中，编码EODl多肤的核酸可包括编码AtEODl或OsEODl的核巧 酸序列或可W是运些序列中的任一个的变体，所述变体编码具有EODl活性的多肤。
[0157] 可在任何目标植物物种中使用常规序列分析技术来鉴别表达或活性如本文所述 被降低的EODl多肤和编码核酸，所述植物物种具体地说作物，如小麦、大麦、玉米、水稻、大 豆；W及另外的农业植物。
[0158] 植物中的DA2突变在本文还显示协同增强DAl和EODl突变的结合对植物中的产量 相关性状的作用。
[0159] 本文所述的方法不限于具体的植物物种，并且DA2、DA1和/或EODl的表达或活性可 在任何目标植物物种中降低，如本文所述。
[0160] 目标植物物种中的DAl、DA2或EODl多肤可具有为本文列出的对应DAl、DA2或EODl 参考氨基酸序列的变体的氨基酸序列。为本文列出的参考序列的变体的DAl、DA2或EODl多 肤可包括与所述参考序列具有至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50%、至少60 %、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性的氨基酸序列。
[0161] 在植物物种中出现的具体氨基酸序列变体可与本文列出的参考序列不同之处在 于1个氨基酸、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或多于50个氨基酸的插入、添加、取代或缺 失。
[0162] 目标植物物种中的DAl、DA2或EODl核酸可具有为本文列出的对应DAl、DA2或EODl 参考核巧酸序列的变体的核巧酸序列。例如，变体核巧酸序列可W是本文列出的参考DAl、 DA2或EODl序列的同源物或等位基因，并且可与所述参考DAl、DA2或EODl核巧酸序列的不同 之处在于核酸中的一个或多个(例如2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或多于50个)核巧酸 的添加、插入、缺失或取代中的一个或多个，从而导致编码的多肤中一个或多个氨基酸的添 加、插入、缺失或取代。当然，包括对核酸进行的对编码的氨基酸序列无影响的变化。DA1、 DA2或EODl编码核酸可包括与参考核酸序列具有至少20%或至少30%序列同一性的序列， 优选至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或 至少98%。序列同一性在上文描述。
[0163] 序列相似性和同一性通常参考算法GAP(Wisconsin Package ,Accelerys , San Diego USA)来定义。GAP使用化edleman和Wunsch算法来比对两个完整序列，所述算法使匹 配的数目最大化并且使空位的数目最小化。通常，使用缺省参数，其中空位创建罚分=12和 空位延伸罚分=4。使用GAP可能是优选的，但也可使用其他算法，例如化AST(其使用 Altschul 等人（1990) J. Mol. Biol. 215 :405-410 的方法）、FASTA(其使用化 arson 和 Lipman (1988)PNAS USA 85:2444-2448的方法）或Smith-Waterman算法（Smith和Waterman( 1981) J.Mol Biol. 147:195-197)或Altschul等人（1990)同上的TBLASTN程序，通常采用缺省参 数。具体地说，可使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res. (1997)253389-3402)。
[0164] 序列比较可在本文所述的相关序列的全长上进行。
[0165] 适合的变体氨基酸和核巧酸序列可使用标准序列分析技术在任何目标植物物种 中鉴别。
[0166] 为本文列出的参考DAl、DA2或EODl核酸序列的变体的DAl、DA2或EODl核巧酸序列 可在严格条件下与所述核酸序列或其互补体选择性地杂交。
[0167] 严格条件包括例如，对于杂交为约80 %-90 %相同的序列，在42 °C下在0.25M Na2HP04(pH7.2)、6.5%SDS、10%硫酸葡聚糖中杂交过夜且在55°C下在0.1XSSC、0.1%SDS 中最终洗涂。对于检测为大于约90%相同的序列，适合的条件包括在65°C下在0.25M Na抽P04，pH7.2、6.5%SDS、10%硫酸葡聚糖中杂交过夜且在60。C下在0.1XSSC、0.1%SDS 中最终洗涂。
[0168] 在植物核酸制剂情况下可能特别适合的替代方案是5x SSPE(最终0.9M NaCU 0.05M憐酸钢、0.005M抓TA pH 7.7)、5X登哈特氏溶液、0.5%SDS的溶液，在50°C或65°C下 过夜。根据需要，洗涂可在65°C下在0.2X SSC/0.1%SDS中进行或在50°C-6(rC下在Ix SSC/ 0.1%SDS中进行。
[0169] 如本文所述的核酸可W是全部或部分合成的。尤其的，它们可W是重组的，在于未 在自然中一起发现的核酸序列（不连续延伸）已被连接或W另外的方式人工组合。或者，它 们可能已经被直接合成，例如使用自动合成仪。
[0170] DA2核酸和DAl和/或EODl核酸的表达可通过任何便利的技术在植物的一个或多个 细胞中降低或消除。
[0171] 用于降低植物中的DA2多肤和DAl和/或EODl多肤的表达或活性的方法是本领域中 熟知的并且在下文更详细地描述。在一些实施例中，活性DA2、DA1和/或EODl多肤的表达可 通过将突变引入植物细胞中的核酸序列中来降低，优选为消除，所述核酸序列编码所述多 肤或调控所述核酸序列的表达。所述突变可破坏DA2、DA1和/或EODl多肤的表达或功能。适 合的突变包括敲除和敲低突变。在一些实施例中，突变可产生DAl的显性阴性等位基因。然 后可从所述突变的细胞再生植物。核酸可通过插入或缺失一个或多个核巧酸来突变。用于 突变、灭活或敲除祀基因的技术是本领域中熟知的（参见例如In Vitro Mutagenesis Protocols；Methods in Molecular Biology(第2版化d Jeff Braman；Sambrook J等人 2012.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4片反）CSH Press;Current Protocols in Molecular Biology ;Ed Ausubel等人（2013)Wiley)。在一些实施例中，可通过基因组编 辑技术将突变引入至祀EODl、DA2或DAl基因中，例如RNA引导核酸酶技术如CRISPR、锋指核 酸酶（ZFN)和转录活化因子样效应物核酸酶（TALEN) (Urno V，F.D.等人Nature reviews .Genetics 11,636-646(2010) ;Joung,J.K.等人Nature reviews .Molecular cell biology 14,49-55(2013) ;Gasiunas，G.等人PNAS USA 109，E2579-2586(2012);Cong，L.等 人Science 339,819-823(2013))。
[0172] 降低表达或活性的序列突变可包括相对于野生型核巧酸序列，一个或多个核巧酸 的缺失、插入或取代，基因扩增或甲基化例如超甲基化的增加或减少。所述一个或多个突变 可W是在核酸序列的编码或非编码区中。编码元件的基因的编码区中的突变可防止全长活 性蛋白质的翻译，即截短突变，或允许全长但无活性或受损的功能蛋白质的翻译，即错义突 变。编码元件的基因的非编码区中，例如调控元件中的突变或表观遗传变化如甲基化可防 止所述基因的转录。包括一个或多个序列突变的核酸可例如通过调控元件的改变的活性编 码具有降低的或消除的活性的变体多肤，或可编码在细胞内具有很少或无表达的野生型多 肤。包括一个或多个序列突变的核酸可相对于未突变的序列具有一个、两个、=个、四个或 更多个突变。
[0173] 例如，可通过在对应于SEQ ID N0:89的位置44的位置处引入突变如缺失、插入或 取代，例如，A至T取代，来降低、优选为消除EODl的活性。EODl多肤序列中等效于SEQ ID NO: 89的位置44的位置可使用标准序列分析和比对工具来鉴别，如表4中所示。
[0174] 可使用标准序列分析技术，例如通过与本文列出的参考序列比较来在任何目标植 物物种中鉴别DA2、DA1和EODl编码序列。
[0175] 适用于消除活性DA2、DA1和/或EODl多肤的表达的突变对于技术人员将是显而易 见的。
[0176] 在一些优选的实施例中，可将降低或消除DA2表达或活性的突变引入至植物细胞 中，所述植物细胞表达显性阴性的DAl多肤且任选地包括i)编码EODl抑制子核酸的异源核 酸或i i)降低EODl表达或活性的突变。
[0177] 在一些实施例中，可通过在植物的细胞内表达异源核酸来降低所述植物细胞中的 DAl、DA2和/或EODl多肤的表达，所述异源核酸编码或转录抑制子核酸，例如抑制子RNA或 RNAi分子。抑制子RNA抑制植物细胞中其祀多肤（即DAl、DA2或EOD1)的表达。
[0178] 如本文所述的核酸可W是全部或部分合成的。具体地说，它们可W是重组的，在于 未在自然中一起发现的核酸序列（不连续延伸）已被连接或W另外的方式人工组合。或者， 它们可能已经直接合成，例如使用自动合成仪。
[0179] 核酸当然可W是双链或单链的、CDNA或基因组DNA或RNA。取决于设计，核酸可W是 全部或部分合成的。通常，技术人员将了解当核酸包括RNA时，对所示的序列的提及应被解 释为对RNA等效物的提及，其中U被T取代。
[0180] "异源"指示已使用遗传工程化或重组方法即通过人干预将所讨论的核巧酸的基 因/序列或调控所讨论的基因/序列的序列引入至植物或其祖先的所述细胞中。对植物细胞 来说异源的核巧酸序列可W是在所述类型、变种或物种的细胞中非天然存在的（即，外源性 的或外来的）或可W是在所述细胞的所述亚细胞或基因组环境中非天然存在的序列或可W 是在所述细胞中非天然调控的序列，即可操作地连接至非天然调控元件。
[0181] 抑制植物细胞中的祀多肤的表达是本领域中熟知的。适合的抑制子核酸可W是相 对于DAl、DA2和/或EODl基因 W反义或有义取向或两者插入的祀DAl、DA2和/或EODl基因的 全部或部分的拷贝，W便实现所述祀基因的表达的降低。参见例如，van der Krol等人， (1990)The Plant Cell 2,291-299;化poli等人，（1990)The Plant Cell 2,279-289; Zhang等人，（1992)The Plant Cell 4，1575-1588^及115-4-5,231，020。此方法的其他改进 可在Wogsz^sAees(Biosource)SAngellfcBaulcombe(IggT)Ilie EMBO Journal 16,12:3675-3684; W及Voinnet&Baulcombe( 1997)NaUire389:第553页中找到。
[0182] 在一些实施例中，抑制子核酸可W是DAl、DA2和/或EODl多肤的表达的有义抑制 子。
[0183] 适合的有义抑制子核酸可W是双链RNA(Fire A.等人化ture，Vol 391,(1998))。 dsRNA介导的沉默是基因特异性的并且经常被称为RNA干扰(RNAiKRNAi是两步骤过程。首 先，dsRNA在细胞内裂解W产生具有5'端憐酸醋和3'短突出端（约化t)的约21-2化t长度的 短干扰RNA (S i RNA)。S i RNA祀向对于破坏特异性的相应mRNA序列（Zamor e P . D . Natur e Structural Biology,8,9,746-750,(2001)〇
[0184] siRNA(有时称为微小RNA)通过结合互补RNA并且触发mRNA消除(RNAi)或阻止mRNA 翻译成蛋白质来下调基因表达。SiRNA可通过加工较长双链RNA来获得，并且当在自然中发 现时通常具有外源性起源。微小-干扰RNA(miRNA)是通过加工短发夹获得的内源性编码的 小非编码RNAdsIRNA和miRNA可抑制携带部分互补的祀序列而无 RNA裂解的mRNA的翻译，并 且降解携带完全互补的序列的mRNA。
[01化]因此，本发明提供基于DAl、DA2和/或EODl核酸序列的RNAi序列用于抑制DAl、DA2 和/或EOD1多肤的表达的用途。例如，RNAi序列可对应于本文列出的参考DA2、DAl或EOD1核 巧酸序列的片段或可W是其变体。
[0186] SiRNA分子通常是双链的，并且为了优化RNA介导的祀基因的功能的下调的有效 性，优选的是选择SiRNA分子的长度和序列W确保由RISC复合物正确识别SiRNA(所述RISC 复合物通过mRNA祀标的SiRNA介导所述识别）并且W使得所述SiRNA短至足W降低宿主应 答。
[0187] miRNA配体通常是单链的并且具有使所述配体能够形成发夹的部分互补的区域。 miRNA是从DNA转录的但未翻译成蛋白质的RNA序列。编码miRNA的DNA序列比miRNA长。此DNA 序列包括miRNA序列和近似反向互补体。当将此DNA序列转录至单链RNA分子中时，miRNA序 列及其反向互补体碱基配对W形成部分双链的RNA区段。微小RNA序列的设计在化hn等人， PLoS Biology，11 (2)，1862-1879，2004上讨论。
[0188] 通常，意图模拟SiRNA或miRNA的作用的RNA分子具有10与40个之间的核糖核巧酸 (或其合成类似物），更优选地17与30个之间的核糖核巧酸、更优选19与25个之间的核糖核 巧酸且最优选地21与23个之间的核糖核巧酸。在本发明的采用双链SiRNA的一些实施例中， 所述分子可具有例如一个或两个(核糖)核巧酸的对称的3'突出端，通常dTdT 3'突出端的 UU。基于本文提供的公开内容，技术人员可容易地设计适合的SiRNA和miRNA序列，例如使用 资源如SiRNA发现者(Ambion) DSiRNA和miRNA序列可合成产生且外源性地添加 W引起基因 下调或使用表达系统(例如载体)产生。在优选的实施例中，合成性地合成siRNA。
[0189] 较长双链RNA可在细胞中进行加工W产生SiRNA(参见例如Myers(2003)Nature Biotechnology 21:324-328)。较长dsRNA分子可具有例如一个或两个(核糖)核巧酸的对称 的3'或5'突出端，或可具有平末端。较长dsRNA分子可W是25个核巧酸或更长。优选地，较长 dsRNA分子的长度是25与30个之间的核巧酸。更优选地，较长dsRNA分子的长度是25与27个 之间的核巧酸。最优选地，较长dsRNA分子的长度是27个核巧酸。可使用载体pDECAP来表达 长度为30个核巧酸或更多的dsRNA(aiinagawa等人，Genes and Dev. ,17,1340-5,2003)。
[0190] 另一个替代方案是在细胞中表达短发夹RNA分子(ShRNA)DShRNA比合成SiRNA更稳 定。ShRNA由通过小环序列分隔的短反向重复序列组成。一个反向重复序列与基因祀标互 补。在细胞中，通过DICER将ShRNA加工成siRNA，所述SiRNA降解祀基因 mRNA且抑制表达。在 优选的实施例中，通过从载体转录内源性地(在细胞内）产生shRNA。可通过在RNA聚合酶III 启动子如人Hl或7SK启动子或RNA聚合酶II启动子控制下用编码ShRNA序列的载体转染细胞 来在所述细胞内产生shRNA。或者，可通过从载体转录外源性地(在体外)合成shRNA。然后可 将ShRNA直接引入至所述细胞中。优选地，ShRNA分子包括DAl、DA2和/或EODl的部分序列。例 如，ShRNA序列的长度在40与100个碱基之间，更优选地长度在40与70个碱基之间。发夹的茎 的长度优选地在19与30个碱基对之间。所述茎可包括G-U配对W使发夹结构稳定。
[0191] 可通过转录优选地包括在载体内的核酸序列来重组地制备SiRNA分子、较长dsRNA 分子或miRNA分子。优选地，SiRNA分子、较长dsRNA分子或miRNA分子包括本文列出的参考 DA2、DA1或EODl核巧酸序列或其变体的部分序列。
[0192] 在其他实施例中，抑制子核酸可W是DAl、DA2和/或EODl多肤的表达的反义抑制 子。在使用反义序列来下调基因表达中，将核巧酸序列置于呈"反向取向"的启动子的控制 下，W使得转录产生RNA，所述RNA与从祀基因的"有义"链转录的正常mRNA互补。参见例如， Rothstein等人，1987; Smith等人，（1988)Nature 3：34,724-726; Zhang等人，（1992)The Plant Cell 4，1575-1588;English等人，（1996)The Plant Cell 8,179-188。反义技术还 综述于Bourque, (1995)，Plant Science 105,125-149和Flavell(1994)PNAS USA 91， 3490-:3496 中。
[0193] 反义抑制子核酸可包括来自为本文列出的参考DA2、DA1或EODl核巧酸序列或其变 体的片段的核巧酸序列的至少10个核巧酸的反义序列。
[0194] 可能优选的是在用于下调祀序列的表达的序列与所述祀序列中存在完全序列同 一性，但是序列的完全互补性或相似性不是必需的。所使用的序列中的一个或多个核巧酸 可与祀基因不同。因此，根据本发明在基因表达的下调中采用的序列可W是选自可获得的 那些的野生型序列(例如基因）或运种序列的变体。
[01%]所述序列不必包括开放阅读框或指定将是可翻译的RNA。可能优选的是存在对应 反义和有义RNA分子的足够同源性W杂交。可能存在基因表达的下调，即使在所使用的序列 与祀基因之间存在约5%、10%、15%或20%或更多错配的情况下。有效地，同源性应足W用 于发生基因表达的下调。
[0196] 抑制子RNA分子可包括编码DA2、DA1和/或EODl多肤的核酸序列的有义或反义链的 10-40个核巧酸。
[0197] 抑制子核酸可W可操作地连接至异源启动子，例如组织特异性或诱导型启动子。 例如，珠被和种子特异性启动子可用于特异性地下调正发育胚珠和种子中的两种或更多种 DAl、DA2和/或EODl核酸W增加最终种子大小。
[0198] 在一些优选的实施例中，DA2抑制子核酸可在具有编码显性阴性的DAl多肤和任选 地EODl抑制子核酸的核酸的植物细胞中表达。
[0199] 编码抑制子核酸和/或显性阴性的DAl多肤的核酸可包括在一种或多种载体中。
[0200] 编码如本文所述的抑制子核酸和/或显性阴性的DAl多肤的核酸可W可操作地连 接至异源调控序列，如启动子，例如如上所述的组成型、诱导型、组织特异性或发育特异性 启动子。
[0201] 编码如本文所述的抑制子核酸和/或显性阴性的DAl多肤的核酸可包括在核酸构 建体或载体上。所述构建体或载体优选地适用于转化至植物细胞中和/或在植物细胞内表 达。载体尤其是呈双链或单链线性或环状形式的任何质粒、粘粒、隧菌体或±壤杆菌属二元 载体，所述载体可W是或可W不是可自我转移的或可移动的，并且所述载体可通过整合至 细胞基因组中或染色体外地存在(例如，自主复制具有复制起点的质粒)来转化原核或真核 宿主，具体地说植物宿主。
[0202] 具体地包括穿梭载体，穿梭载体意指天然地或通过设计能够在两种不同的生物体 中复制的DNA媒介物，所述DNA媒介物可选自放线菌属和相关物种、细菌和真核(例如高等植 物、哺乳动物、酵母或真菌)细胞。
[0203] 如上所述的包括核酸的构建体或载体不必包括启动子或其他调控序列，特别是如 果所述载体不用于将核酸引入细胞中W用于重组至基因组中。
[0204] 构建体和载体还可包括由赋予可选择表型（如对抗生素的抗性）的基因组成的可 选择遗传标志物，所述抗生素如卡那霉素、潮霉素、草下麟(phospMnotricin)、氯横隆、甲 氨蝶岭、庆大霉素、壮观霉素、咪挫嘟酬类、草甘麟和d-氨基酸。
[0205] 本领域的技术人员能够例如在微生物或植物细胞中构建载体且设计用于重组基 因表达的方案。可选择或构建含有适当的调控序列的适合载体，所述调控序列包括启动子 序列、终止子片段、聚腺巧酸化序列、增强子序列、标记基因 W及适当的其他序列。对于进一 步细节，参见例如，Molecular Cloning: a LaboratoiT Manual:第3版，Sambrook 等人， 2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press和Protocols in Molecular Biology,第二 版，Ausubel等人编辑化hn Wiley&Sons，1992。先前使用的在植物上具有广泛成功的特定程 序和载体由Bevan,Nucl .Acids Res. (1984) 12,8711-8721) W及Guerineau和MulIineaux, (1993)P1曰nt transformation and expression vectors.In=Plant Molecular Biology Labfax(Croy R畑编辑)0xford,BIOS Scientific Publishers,第1