Al的C末端是否与DA2相互作用。免疫共沉 淀分析显示在GFP-DA2复合物中检测到DAl的C末端区域(Myc-DAl-C),但未在阴性对照 (PEX10-GFP，一种RING型E3泛素连接酶）中检测到(Platta等人，2009 ;Kaur等人，2013)。因 此，运些结果指示DAl的C末端区域是与DA2在体外和体内相互作用所需的。
[0342] 高等植物中的种子大小是进化适应性的关键决定因素，并且还是作物驯化中的重 要农艺性状(Gomezjo(MiorsdPhnkskyjoog)D
[0%引已鉴别了母体地作用W控制种子大小的若干因子，如ARF2/MNT、AP2、KLU/ CYP78A5、E0D3/CYP78A6和DA1。然而，运些因子在种子大小控制中的遗传和分子机制几乎是 完全未知的。我们先前证明了泛素受体DAl与E3泛素连接酶E0D1/BB协同作用来控制种子大 小(Li 等人，2008)。
[0344] 在此研究中，我们鉴别了作为另一种RING E3泛素连接酶的拟南芥DA2参与控制种 子大小。遗传分析表明DA2与DAl协同起作用来控制最终的种子大小，但独立于E3泛素连接 酶EODl来控制最终的种子大小。我们进一步掲示DAl与DA2物理地相互作用。我们的结果定 义了控制拟南芥的最终种子大小的设及DAUDA2和EODl的基于泛素的系统。
[0345] 2.9 DA2母体地作用来控制种子大小
[0346] da2-l功能缺失突变体形成大的种子和器官，而过度表达DA2的植株产生小的种子 和器官（图1A)，从而指示DA2是种子和器官大小控制的负因子。出人意料地，拟南芥DA2最近 已被提出作为器官生长的正调控因子，尽管关于DA2如何控制种子和器官生长一无所知 (Van Daele等人，2012)。在此研究中，我们有足够的证据来证明DA2充当种子和器官生长控 制的负因子。da2-l功能缺失突变体形成大的种子和器官（图1至4)。(1曰2-1突变协同增强 dal-1和dal-kol的种子和器官大小表型（图1至4)支持了运一点。da2-l突变还增强eodl-2 的种子和器官大小表型，从而进一步指示da2-l突变促进种子和器官生长。da2-l突变体在 珠被中形成具有更多细胞的大胚珠，并且da2-l突变协同增强dal-1的胚珠大小表型（图6)。
[0347] 此外，过度表达DA2和DA化的大多数转基因植株比野生型植株更小（图2;图S9)。运 些转基因植株的器官生长表型与其对应表达水平相关（图S4和S9)。因此，我们的数据清楚 地证明DA2充当种子和器官大小的负调控因子。具有大器官的若干拟南芥突变体也形成大 种子化rizek，1999; Mi Z 址am 巧日 Fischer，2000; Schruff 等人，2006; Li 等人，2008; Adamski 等人，2009)，从而表明器官大小与种子生长之间的可能联系。与此相反，具有大器官的若干 其他突变体表现出正常大小的种子化U等人，2003;White ,2006 ;Xu和Li ,2011)，从而指示器 官和种子大小不总是正相关的。运些结果表明种子和器官具有共有和不同的途径来控制其 对应大小。
[0348] 正反交实验表明DA2母体地作用来影响种子生长，并且DA2的胚芽和胚乳基因型不 会影响种子大小（图6)。围绕胚珠的珠被是母体组织并且在受精之后形成种皮。母体珠被大 小的改变(如在arf2、dal-l和klu胚珠中观察到的那些）已知促成种子大小的变化(Sc虹Uff 等人，2006;Li等人，2008;Adamski等人，2009)。成熟da2-l胚珠也大于成熟野生型胚珠（图5 和7)。(1曰2-1突变还协同增强dal-1胚珠的珠被大小。因此，从运些研究显现的总主题是控制 母体珠被大小是用于决定最终种子大小的关键机制之一。与此看法一致，迄今为止分离的 种子大小控制的植物母体因子(例如KLU、ARF2和DA1)影响珠被大小(Schruff等人，2006;Li 等人，2008; Adamski 等人，2009)。
[0349] 珠被或种皮的大小是通过细胞增殖和细胞扩增运两个协调的过程来决定的。成熟 胚珠的珠被中的细胞数目设定了在受精之后种皮的生长潜力。例如，3计2突变体产生具有 更多细胞的大胚珠，从而产生大种子(Schruff等人2006)，而klu突变体具有有更少细胞的 小胚珠，从而产生小种子(Adamski等人，2009)。我们的结果表明dal-1和da2-l种子的珠被 比野生型种子的珠被具有更多细胞，并且dal-1和da2-l协同作用来促进珠被中的细胞增 殖。我们还观察到dal-1、da2-l和dal-1 da2-巧中子的外珠被中的细胞比野生型珠被中的细 胞更短，从而表明母体珠被中细胞增殖与细胞伸长之间的可能的补偿机制。因此，有可能充 当种子生长的物理约束的母体珠被或种皮能够设定最终种子大小的上限。
[0350] 2.10用于泛素介导的种子大小控制的遗传框架
[0351] DA2编码具有不同于先前描述的植物RING结构域中的任一者的一个预测的RING结 构域的蛋白质。DA2的RING结构域与水稻GW2 (巧HC2)的RING结构域共有最高同源性，但其缺 乏由天冬酷胺残基替代的一种保守的金属配体氨基酸(组氨酸残基KSong等人，2007)。仍 然有可能DA2的RING结构域可W是在GW2中发现的RING结构域的变体。许多RING型结构域在 E3泛素连接酶中被发现，泛素化底物经常祀向它们用W随后的蛋白酶体降解（Smalle和 Vierstra, 2004)。我们测试了体外泛素连接酶测定中重组DA2的E3活性并且证明了 DA2是功 能性E3泛素连接酶，从而表明DA2可祀向细胞增殖的正调控因子W用于通过26S蛋白酶体进 行泛素依赖性降解。与RING结构域外部的DA2共有同源性的蛋白质在拟南芥和其他植物物 种中被发现。在拟南芥中，M2样蛋白（DA化)与DA2共有广泛的氨基酸相似性。与35S:DA2植 株一样，DA化过度表达系表现出较小植株（图18)，从而指示DA2和DA化可行使类似的功能。 水稻中DA2的同源物是RING型(C5HC2)蛋白GW2(Song等人，2007)，其已知充当种子大小的负 调控因子。然而，GW2在种子大小控制中的遗传和分子机制在水稻中在很大程度上是未知 的。
[0352] 我们先前鉴别了DAl，一种具有泛素结合活性的泛素受体，作为种子大小的负调控 因子化i等人，2008)。修饰基因筛选鉴别了 dal-1的一种增强子化ODlKLi等人，2008)，所述 增强子是与E3泛素连接酶BB等位的（Disch等人，2006)。双eodl-2dal-l突变体的分析掲示 DAl与EODl之间的协同遗传相互作用化i等人，2008)，从而表明它们可通过调节共有祀标的 活性来控制种子生长。虽然dal-1与eodl-2之间的遗传相互作用也协同增强种子和器官大 小，但遗传分析表明DA2独立于EODl作用来影响种子生长，从而表明DA2和EODl可祀向用于 降解的不同生长刺激物，其中经由DAl共同调控。因此，我们的发现建立了通过S种泛素相 关的蛋白质DA1、DA2和EODl用于控制种子和器官大小的框架。此外，我们观察到GW2的过度 表达限制拟南芥中的种子和器官生长，从而提供了拟南芥和水稻中的可能的保守功能的指 示。在水稻中研究GW2和DAl及EODl的水稻同源物的结合对谷粒大小的作用可能会很有趣。
[0紙3] 2.11 DAl和DA2在种子大小控制中的可能的分子机制
[0354] 我们的结果证明E3泛素连接酶DA2与泛素受体DAl在体外和体内相互作用（图12-14)。然而，不太可能的是DA2祀向DAl W用于蛋白酶体降解，因为DAl基因的T-DNA插入的突 变体(dal-kol)协同增强da2-l的种子大小表型（图3和4)。然而，许多其他类型的泛素修饰 W蛋白酶体非依赖性方式调控蛋白质（Schnell和化cke，2003)。例如，单泛素化一直牵设在 信号传导蛋白的活化、内吞作用和组蛋白修饰中（Schnell和化Cke ,2003)。在动物中，泛素 受体eps 15的单泛素化取决于eps 15与E3连接酶的化dd4家族之间的相互作用(Woe化等人， 2006)。与此相反，还报道了泛素受体的E3非依赖性单泛素化化oeller等人，2007)。考虑到 DAl与DA2相互作用，我们测试了DA2是否能够泛素化或单泛素化DAl。在El、E2和泛素存在 下，DA2-His具有E3泛素连接酶活性。然而，在E1、E2、泛素和DA2-His化3)存在下，在我们的 反应条件下未检测到泛素化的DA1-HA。泛素受体能够经由结构域UIM与E3的聚泛素化的底 物相互作用，并且通过蛋白酶体促进其降解(Verma等，2004)。我们先前证明了DAl的UIM结 构域能够结合泛素化i等人，2008)。
[0355] 总之，在DAl通过其C末端区与DA2相互作用的情况下（图12和14)，DA1可参与介导 通过蛋白酶体降解DA2的泛素化底物。一种机制可设及DAl与DA2的相互作用，其有助于DAl 特异性地识别DA2的泛素化底物。DAl可随后通过其UIM结构域结合泛素化底物的聚泛素链 并且介导所述聚泛素化底物的降解。提高种子产量是全世界范围内作物育种的重要目标， 并且种子的大小是总种子产量的重要组成部分。我们鉴别了 DA2作为种子大小的重要调控 因子，其与DAl协同起作用来影响种子大小。
[0巧6] DAl还与EODl协同作用来影响种子生长。显性阴性的dal-1突变(Zmdal-I)的过度 表达据报道增加谷物的种子质量(Wang等，2012)，运表明了结合来自不同种子作物的DA1、 DA2和EODl的作用W在运些作物中工程化大种子大小的前景。
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[040引 表 1:DA2 RING结构域的比对(SEQ ID N0:3-19)。
[0412] 表2:DA2多肤的比对(SEQ ID N0:20-35)
[0413] *指示相同残基
[0414] :指示保守的残基
[0415] .指示半保守的残基
[0416] RING结构域W及第一和第二共有结构域加框。
【主权项】
1. 一种增加植物的产量的方法，所述方法包括： 降低所述植物的细胞内的DA2多肽的表达或活性， 其中所述植物具有降低的DA1和/或E0D1表达或活性。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物具有降低的E0D1活性。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述植物具有降低的DA1表达或活性。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述植物表达显性阴性的DA1多肽。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述DA2多肽的表达或活性在所述植 物的细胞中被消除。6. -种增加植物的产量的方法，所述方法包括： 降低DA2多肽的表达或活性，以及； 降低所述植物的细胞内的DA 1多肽和/或EOD多肽的表达或活性。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括降低所述植物的细胞内的E0D1多肽 表达或活性。8. 根据权利要求7所述的方法，其中通过将突变引入所述植物细胞的核苷酸序列中并 且从突变的细胞再生所述植物来降低所述E0D1多肽的表达或活性，所述核苷酸序列编码所 述E0D1多肽或调控其表达。9. 根据权利要求7所述的方法，其中通过将异源核酸并入所述植物细胞中来降低所述 E0D1多肽的表达或活性，所述异源核酸表达降低所述E0D1多肽的表达的抑制子核酸。10. 根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低所述植物的细胞 内的DA1多肽表达或活性。11. 根据权利要求10所述的方法，其中通过将突变引入所述植物细胞的核苷酸序列中 并且从突变的细胞再生所述植物来降低所述DA1多肽的表达或活性，所述核苷酸序列编码 所述DA1多肽或调控其表达。12. 根据权利要求10所述的方法，其中通过将异源核酸并入所述植物细胞中来降低所 述DA1多肽的表达或活性，所述异源核酸表达降低所述DA1多肽的表达的抑制子核酸。13. 根据权利要求10所述的方法，其中通过在所述植物的细胞内表达显性阴性的DA1多 肽来降低所述DA 1多肽的表达或活性。14. 根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中通过将突变引入所述植物细胞的核 苷酸序列中并且从突变的细胞再生所述植物来降低所述DA2多肽的表达或活性，所述核苷 酸序列编码所述DA2多肽或调控其表达。15. 根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中通过将异源核酸并入所述植物细胞 中来降低所述DA2多肽的表达或活性，所述异源核酸表达降低所述DA2多肽的表达的抑制子 核酸。16. 根据权利要求6至16中任一项所述的方法，其中所述DA2多肽的表达或活性在所述 植物的细胞中被消除。17. -种产生具有增加的产量的植物的方法，所述方法包括： 提供缺乏DA 1、EOD 1或DA 1和EOD 1两者的表达或活性的植物细胞， 并入降低DA2多肽的表达或活性的异源核酸;或将降低DA2多肽的表达或活性的突变引 入所述植物细胞中，以及； 从一个或多个转化的细胞再生所述植物。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述植物细胞缺乏E0D1多肽表达或活性。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述植物细胞包括所述植物细胞的核苷酸序列 中的突变，所述核苷酸序列编码所述E0D1多肽或调控其表达;或另一异源核酸，所述异源核 酸表达降低所述植物细胞中的所述E0D1多肽的表达的抑制子核酸。20. 根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述植物细胞缺乏DA1多肽表达或 活性。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述植物细胞包括所述植物细胞的核苷酸序列 中的突变，所述核苷酸序列编码所述DA1多肽或调控其表达;另一异源核酸，所述异源核酸 表达降低所述植物细胞中的所述DA1多肽的表达的抑制子核酸;或另一异源核酸，所述异源 核酸在所述植物的细胞内表达显性阴性的DA1多肽。22. 根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述异源核酸表达抑制子核酸至 所述植物细胞中，所述抑制子核酸降低所述DA2多肽的表达。23. 根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述异源核酸消除所述植物的细 胞中的DA2多肽的表达或活性。24. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物相对于野生型植物具有增 加的植株大小、种子大小和/或器官大小。25. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码显性阴性的DA多肽和/或抑制子 核酸的核酸可操作地连接至异源启动子。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。28. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中异源核酸被包括在一种或多种载体 中。29. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，所述方法包括有性或无性繁殖或生长具 有降低的DA2表达或活性的所述植物的子代或后代。30. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DA2多肽包括SEQ ID NO: 1的 RING结构域。31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述DA2多肽包括SEQ ID N0:2的RING结构域。32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述DA2多肽包括SEQ ID N0:36的第一共有结构 域。33. 根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述DA2多肽包括SEQ ID NO: 37的 第二共有结构域。34. 根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述DA2多肽包括与SEQ ID N0:20 至35中的任一者具有至少20%序列同一性的氨基酸序列。35. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DA1多肽包括SEQ ID N0:68的 ΙΠΜ1结构域和SEQ ID从):69的1]頂2结构域。36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述DA1多肽包括SEQ ID NO: 38或39的UM结构 域。37. 根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述DA1多肽包括与SEQ ID N0:45 的残基229至532具有至少20%序列同一性的C末端区域。38. 根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述DA1蛋白包括与SEQ ID N0:41 至64中的任一者具有至少20 %序列同一性的序列。39. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中显性阴性的DA1包括在所述DA1多肽 的氨基酸序列中等效于SEQ ID NO:45的DA1多肽的位置358的位置处的R至K取代。40. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述E0D1多肽包括与SEQ ID N0:74 至90中的任一者具有至少20%序列同一性的序列。41. 根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述植物是高等植物。42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述植物是选自由以下各项组成的组的农业植 物:紫草、红豆杉属、烟草、萌芦、胡萝卜、芸薹属蔬菜、瓜、辣椒、葡萄树、莴苣、草莓、芸薹属含 油种子、甜菜、小麦、大麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、高梁、向日葵、西红柿、土豆、胡椒、菊花、 康乃馨、亚麻籽、大麻以及黑麦。43. -种植物，所述植物具有降低的DA2多肽的表达或活性以及降低的DA1多肽和/或 E0D1多肽的表达或活性， 其中通过将异源核酸并入所述植物的一个或多个细胞中来降低所述DA2多肽、所述DA1 多肽和所述E0D1多肽中的一个或多个的表达或活性。44. 根据权利要求43所述的植物，所述植物通过根据权利要求1至42中任一项所述的方 法产生。
【专利摘要】本发明涉及植物E3泛素连接酶(被称为DA2)，其与DA1协同作用来控制种子和器官大小。提供了增加植物产量的方法，该方法包括在缺乏DA1表达或活性的植物中降低DA2的表达或活性。还提供了具有增加的产量的植物和产生这类植物的方法。
【IPC分类】C07K14/415, A61K38/53, C12N15/82
【公开号】CN105612171
【申请号】CN201480045197
【发明人】李云海, 夏天, 李娜, 杰克·杜梅尼尔, 迈克尔·贝文
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所, 植物生物科学有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2014年7月30日