用于鼻咽癌筛查的方法和装置的制造方法
【专利说明】
[0001] 相关申请案的交叉引用
[0002] 本申请要求保护2013年10月4日提交的美国临时申请第61 /886，807号的优先权的 权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及用于筛查鼻咽癌的方法、组合物和装置。
[0004] 发明背景
[0005] 鼻咽癌症(NPC)是流行地区如太平洋和地中海沿岸国家及亚北极地区中年受试者 高度流行的恶性肿瘤。NPC是中国南方因病死亡的主要原因。遗传和环境因素促成肿瘤风 险，并且在NPC流行区的高发病率和高人口密度使得NPC成为全球的常见癌症。估计全球的 高危人群为13-15亿人。每年在北美约有500个新病例，在香港和台湾有5000个病例并且全 世界有100,000个病例（Ungl999 KNPC因为其与人γ疱疹病毒4、爱波斯坦-巴尔病毒 (Epstein-Barr Virus) (EBV)密切、接近绝对的关联，所以是不常见的癌症，每个肿瘤细胞 隐匿多个拷贝的在早期、侵袭前病变中已经可检测的相同病毒克隆（Pathmanathanl995)。 NPC出现在鼻后远侧空间，这里NPC可发展很少症状，并且在转移组织中首次诊出并不罕见， 因此预后不良（Skinnerl990;H 〇1998)。尽管在相关人口中发病率和意识越来越高，但是NPC 的现实仍受后期诊断而控制，通常通过鼻咽镜检查，在早期检测到的肿瘤预后良好(Liu 1998)〇
[0006] 数十年来，EBV和NPC之间的密切关联已经吸引了为改进对NPC风险的临床诊断的 尝试。Raab-Traub(1987)证明所有组织学子集的NPC均含EBV DNA。虽然EBV血清学的大型调 查描绘了显著关联(例如Zeng 1986)，但是几乎所有人类的泛在EBV载体状态妨碍EBV血清 学得到临床应用(H〇1998)。血清学高度灵敏但是缺乏特异性。
[0007] 1992年首次证明了通过分子生物学手段检测EBV基因组进行鼻后活检的诊断希望 (Feinm esserl992)。虽然生物样品中EBV基因组的分子检测已经成为健全常规程序，但是从 小型学术研究(Tunel999)到常规流动式应用的转变因为缺乏专用、一次性活检仪器并且需 要快速、局部DNA分离以免DNA降解，所以很困难。两者均提出挑战，尤其是在具有不同技术 基础设施水平的流行区。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明人已经开发了一种用于筛查鼻咽癌症的高特异性和高灵敏度方法。
[0010]因此，本公开提供了一种在测试受试者中检测NPC或发展NPC的风险的方法，其包 括(a)提供鼻咽样品，（b)从所述样品分离DNA及(c)使用实时PCR由所述DNA扩增并检测至少 一个EBV靶序列，其中小于或等于31.5的实时PCR循环阈值次数表明所述测试受试者有鼻咽 癌或发展鼻咽癌的风险。
[0011] 在一个实施方案中，28至31.5的实时PCR循环阈值次数表明所述测试受试者有发 展鼻咽癌的风险。
[0012] 在另一个实施方案中，小于或等于28的实时PCR循环阈值次数表明所述测试受试 者有鼻咽癌。
[0013]循环阈值(Ct)可用于计算爱波斯坦-巴尔病毒检测水平(EDL)。具体而言，Ct值可 用于通过使用以对照EBV样品生成的标准曲线测定EBV拷贝数。EBV拷贝数的对数提供了 EDL。表15展示了 Ct值、EBV拷贝和EDL之间的相关性。
[0014]在一个实施方案中，大于或等于2.7的EDL表明受试者患有NPC。
[0015]在另一个实施方案中，小于1.7的EDL表明受试者未患NPC。
[0016] 再一个实施方案中，介于1.7和2.6之间的EDV是不明确的结果并且测试受试者应 在合适的间隔，例如6至8周复检。
[0017] 在一个实施方案中，由刷拭活检提供鼻咽样品。
[0018] 在另一个实施方案中，鼻咽样品包含上皮细胞。
[0019] 在另一个实施方案中，由40-60ng，任选约50ng的DNA扩增所述至少一个EBV靶序 列。
[0020] 在另一个实施方案中，所述至少一个EBV靶序列在EBNA1基因中。
[0021] 在另一个实施方案中，使用对应于SEQIDN0:1和2的引物扩增所述至少一个EBV靶 序列。
[0022] 在另一个实施方案中，使用对应于SEQIDN0:4的探针检测所述至少一个EBV靶序 列，其中所述探针在5'-末端标记有报告因子焚光团而在3'-末端标记有猝灭因子焚光团。
[0023] 本发明人还已开发了用于获得刷拭活检的改进装置。在一个实施方案中，刷拭活 检装置用于获得可以用于本文描述的方法中的鼻咽样品。
[0024] 因此，本公开提供了一种用于获得刷拭活检样品的装置，其包括具有第一端和第 二端的纵轴，其中至少两个刷头从所述轴的第二端延伸。
[0025] 在一个实施方案中，所述至少两个刷头包括连接到刷轴上的接触区，所述刷轴从 所述轴的第二端延伸。
[0026] 在另一个实施方案中，接触区包括采样表面。
[0027] 在另一个实施方案中，采样表面包括带毛表面、锯齿形表面、蜂巢表面、锯齿表面 或多孔表面。
[0028] 在另一个实施方案中，所述至少两个刷头通过颈区连接到所述轴的第二端。
[0029] 在另一个实施方案中，颈区呈0至90度，任选地约65至75度角延伸到所述轴的纵轴 线。
[0030] 在另一个实施方案中，刷头从颈区呈0至90度，任选地约65至75度角延伸。
[0031 ]在另一个实施方案中，所述至少两个刷头通过刷接头区相互连接。
[0032]在另一个实施方案中，所述两个刷头相互平行。
[0033] 在另一个实施方案中，所述两个刷头之间的距离为0.5cm至5.0cm，任选地约1.0至 2.0cm〇
[0034]在另一个实施方案中，所述两个刷头从所述第二端向外延伸形成V形。
[0035] 在另一个实施方案中，所述V形的角度为10至150度，任选地约20至90度。
[0036]在另一个实施方案中，在V形的最宽处所述两个刷头之间的距离为0.5至5.0cm，任 选地1 · 0至2 · 0cm。
[0037]在另一个实施方案中，接触区可从刷轴上拆卸。
[0038]在另一个实施方案中，所述轴呈叶片或杆状。
[0039] 在另一个实施方案中，所述轴长度为5至30cm或任选地长度为约13至19cm。
[0040] 本公开还提供了一种用于获得刷拭活检样品的装置，其包括具有第一端和第二端 的纵轴及从所述轴的第二端延伸的至少一个刷头，其中所述至少一个刷头可在第一未充气 位置和第二充气位置之间移动。
[0041] 在一个实施方案中，刷头在第一未充气位置未伸长而在第二充气位置伸长。
[0042] 在另一个实施方案中，刷头为1至10cm，任选地3至7cm，在所述第二伸长位置比在 所述第一未伸长位置更长。
[0043] 在另一个实施方案中，刷头包括可充气接触区和刷轴。
[0044] 在另一个实施方案中，刷头的接触区包括用于提供活检样品的采样表面。
[0045] 在另一个实施方案中，采样表面包括少于50%、40%、30%、20%或10%的接触区。
[0046] 在另一个实施方案中，采样表面在第一未充气位置在接触区的内部而在第二充气 位置在接触区的外部。
[0047] 在另一个实施方案中，采样表面包括带毛表面、刷面、锯齿形表面、蜂巢表面、锯齿 表面或多孔表面。
[0048] 在另一个实施方案中，轴包括用于为刷头充气的工具。
[0049] 在另一个实施方案中，轴连接到手柄，手柄包括用于为刷头充气的工具。
[0050] 在另一个实施方案中，手柄可从轴上拆卸。
[0051] 在另一个实施方案中，所述装置包括从所述轴的第一端延伸的手柄，手柄包括发 光体。
[0052] 在另一个实施方案中，发光体定向为沿着所述轴的纵轴线提供照明。
[0053]在另一个实施方案中，手柄可从轴上拆卸。
[0054]在另一个实施方案中，所述轴的第一端可插入手柄上的插孔内。
[0055] 本公开还提供了提供来自于受试者的鼻咽样品的方法，所述方法包括使受试者的 鼻咽部与本文描述的任一装置接触。在一个实施方案中，所述方法经口进行。
[0056] 本公开还提供了一种提供来自于受试者的口腔、口咽或下咽部样品的方法，所述 方法包括使受试者的口腔、口咽或下咽部与本文描述的装置接触。
[0057] 附图简述
[0058]现将关于附图对本公开进行描述，其中：
[0059] 图1示出了经口刷拭过程。（A)用轻微正向压力，将毛刷压在鼻咽壁上并且开始刷 拭运动以从鼻咽表面采集上皮细胞样品。（B)经口刷拭装置。
[0060] 图2(A)示出了描绘刷尖在鼻后壁的定位的内窥镜图像。图2(B)示出了显示出最少 浸渍出血的刷拭后粘膜表面的内窥镜图像。
[0061] 图3示出了各种电子显微镜图像。(A)示出了未用的经口刷尖。（B)示出了具有截留 的NP组织的刷尖的低倍放大图。（C)示出了收获的大部分完整的NP上皮细胞的中等放大图 (150幻。〇)示出了带有具有细胞粘附的完整上皮细胞层的NP组织收获物的高倍放大图 (600x)〇
[0062] 图4示出了 NPC实体瘤和正常受试者的EDL值的分布模式。两种组织病理学类型之 间明显的显著界限展示出这种测定法区别无 NPC分子标记的患者与有NPC分子标记的患者 的潜力。
[0063] 图5示出了经刷拭的NPC肿瘤和正常受试者的EDL值的分布模式。所述两组用除一 个假阴性结果以外的单独曲线清楚地描绘。
[0064] 图6示出了实时PCR中的4个主要阶段;线性基态期、早期对数期、对数-线性期和平 台期。
[0065] 图7示出了 ABlPrism?SDS的典型扩增曲线。
[0066] 图8示出了具有分叉刷头的刷拭活检装置。（A)是刷拭活检装置(B)的分叉刷头的 放大图。
[0067] 图9示出了分叉刷头的不同构造。（A)和(B)示出了非平行分叉刷头。(A)是(B)的刷 拭活检装置的非平行分叉刷头的放大图。（C)和(D)示出了平行分叉刷头。（C)是(D)的刷拭 活检装置的平行分叉刷头的放大图。
[0068] 图10示出了可用在采集样品的刷拭活检装置上的各种表面。(A)示出了多孔表面， (B)示出了蜂巢环形表面，（C)和(D)示出了锯齿形或锯齿表面。
[0069]图11示出了可以与刷拭活检装置一起使用的各种轴。（A)描绘了叶片，（B)描绘了 杆并且(C)详述了颈部接头区和刷头的角度。
[0070] 图12(A-C)示出了可拆式刷头。
[0071] 图13描绘了使用中的可充气刷头。（A)描绘了充气之前(在鼻咽下方）的可充气刷 头而(B)描绘了充气之后(在鼻咽内部)的可充气刷头。
[0072] 图14描绘了呈其未充气（（A)和(D))和充气（（B)和(E))形式的可充气刷头。（C)是 沿线i-i截取的图13(B)的充气刷头的横截面图。
[0073]图15描绘了仅在充气后露出接触表面的可充气刷头。（C)描绘了接触表面未露出 的未充气刷头而(D)描绘了接触表面露出的充气刷头。(A)是沿(C)的线i-i截取的未充气刷 头的横截面图。(B)是沿(D)的线ii-ii截取的充气刷头的横截面图。
[0074]图16描绘了在可充气刷头的轴内的空气通道。
[0075] 图17(A)和(B)描绘了包括用于为刷头充气的工具的可充气刷头。
[0076] 图18(A)和(B)描绘了连接到装有用于为刷头充气的工具的手柄上的可充气刷头。 [0077]发明详述
[0078]本公开的方法
[0079]本发明人已经开发出一种用于筛查鼻咽癌症的高特异性和高灵敏度方法。
[0080]因此，本公开提供了一种在测试受试者中检测鼻咽癌或发展鼻咽癌的风险的方 法，其包括：
[0081 ] a.提供来自于所述受试者的鼻咽样品，
[0082] b.从所述样品分离DNA，
[0083] c.使用实时PCR由所述DNA扩增并检测至少一个EBV靶序列，
[0084]其中小于或等于31.50的实时PCR循环阈值次数表明所述测试受试者有鼻咽癌或 发展鼻咽癌的风险。
[0085] 如本文中所用，术语"鼻咽癌症（nasopharyngeal cancer)"或"鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma)(NPC)"是指从鼻咽粘膜上皮产生的恶性赘生物或癌症。鼻咽 癌的分期基于临床和放射性检查：1期是限于鼻咽的小肿瘤，II期是局部区域扩大的肿瘤， 或是具有有限颈部(结节)疾病的任何证据的肿瘤，III期是有或无颈部疾病的大型肿瘤，或 有双侧颈部疾病的肿瘤而IV期是涉及颅内或颞下区域、广泛性颈部疾病和/或任何远端转 移的大型肿瘤。鼻咽癌与感染爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)相关。爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)是 人DNA肿瘤病毒。每个NPC肿瘤细胞携带促成肿瘤发展的附加体EBV拷贝。
[0086] 如本文中所用，措辞"检测鼻咽癌症"还指在症状发生前的受试者中检测鼻咽癌 症。"检测鼻咽癌症"还包括检测鼻咽癌症的严重程度、进展和/或分期，或放射或化学治疗 后局部或区域性复发的出现。
[0087] 措辞"检测鼻咽癌症"还包括预测鼻咽癌症的预后、治疗结果以及存活时间。
[0088] 如本文中所用，措辞"提供鼻咽样品"是指从受试者获得鼻咽的样品或活检的任何 方式。鼻咽是咽部最上面的部分。提供或获得鼻咽样品的方法在本领域中公知。
[0089] "提供鼻咽样品"包括提供来自于鼻咽表面的组织和/或细胞样品。在一个实施方 案中，细胞为上皮细胞如鳞状上皮细胞和呼吸道上皮细胞。在其它实施方案中，细胞为淋巴 样细胞(淋巴细胞)或血细胞。
[0090] 可经鼻或经口获得样品。在一个优选实施方案中，经口获得样品，因为与可能不适 且在患者中难以进行的经鼻途径相比，这是相对舒适且无创伤的进入鼻咽的方式，极少出 血或不出血。在经鼻方法中涉及从贯穿鼻部的鼻咽两侧通过前后鼻腔的活检。经口方法同 样地通过一个入口点进入鼻咽的两侧。在一个实施方案中，使用毛刷或拭子从鼻咽获得组 织和/或细胞，优选上皮细胞的样品。使用毛刷获得的组织和/或细胞的样品也称为"刷拭活 检"。下面更加详细地描述了用于获得鼻咽样品的刷拭活检装置的实例。
[0091] 本方法包括从鼻咽样品分离DNA。在一个实施方案中，DNA为总DNA。从组织或细胞 样品分离或提取D N A的方法在本领域公知。例如，可使用商业试剂盒如来自于R 〇 c h e Diagnostics的MagNA核酸分离液和MagNA纯LC DNA分离试剂盒提取DNA。再如，使用DNA提取 机器人提取DNA，如来自于9604型的Qiagen自动化DNA提取。
[0092]提取之后，任选地为DNA定量并标准化为特定浓度。DNA定量方法在本领域公知。例 如，任选地使用荧光结合染料结合荧光测定法为DNA定量。在一个实施方案中，将DNA浓度标 准化为8-12ng/yl，任选地10或约lOng/μΙ。
[0093]本方法包括对DNA进行实时PCR。在一个优选实施方案中，在DNA已经标准化为特定 浓度之后，对DNA进行实时PCR。在一个实施方案中，对约5yL约lOng/μΙ的等分试样或50ng的 总DNA进行实时PCR。本领域的技术人员将认识到可以使用其它DNA浓度(例如，1至50ngAU， 任选地5至20ngAU)和量（例如，10至100ng，任选地25至75ng的DNA)。
[0094] "实时PCR"或"实时聚合酶链式反应"是一种用于扩增并同时量化核酸序列的方 法。该程序按照聚合酶链式反应(PCR)的一般原理。PCR为本领域的技术人员公知。PCR依赖 于为了 DNA解链和核酸酶促复制的反应的重复加热和冷却循环。含有与靶区互补的序列的 引物连同DNA聚合酶使得选择性重复扩增成为可能。随着PCR进行，生成的DNA本身用作复制 的模板并且因此DNA模板随着反应的进行呈指数性扩增。在实时PCR中，在反应进行时检测 反应的产物。检测实时PCR中的产物的两种常用方法是：（1)插入任何双链DNA的非特异性荧 光染料，和(2)由标记了仅允许在探针与其互补DNA靶标杂交之后检测的荧光报告因子的寡 核苷酸组成的序列特异性DNA探针。
[0095] 如本文中所用，术语"EBV靶序列"是指EBV基因组中存在的核酸序列。EBV基因组序 列的实例为基因库登录号V01555的EBV B95.8基因组序列。EBV靶序列任选地长度为10-200、15-150、20-120、30-110、40-100、50-90、60-85 或 70-80 个核酸残基。在一个实施方案 中，EBV靶序列是EBV基因组中存在但是在受试者的基因组中不存在的核酸序列。在另一个 实施方案中，EBV靶序列是已知编码在EBV相关恶性肿瘤如鼻咽癌症中表达的病毒蛋白的 EBV基因中存在的核酸序列。EBV靶序列的实例包括EBNA1基因中所含的序列。EBNA1也称为 爱波斯坦-巴尔核抗原1并且编码EBV病毒蛋白。
[0096] 例如，在以下EBV基因组中可以找到EBNA1序列：
[0097] ?人疱疹病毒4完整野生型基因组
[0098] 〇171，823bp 环状 DNA
[0099] ?登录号：AJ507799 · 2 ;GI: 86261677
[0100] ?爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)基因组，菌株B95-8
[0101] 〇17