反应），达到验收 标准，23.00 < Ct (VICH 28.00(表12)。阈值Ct (VIC) >28.00，可指示PCR受抑制。频率:为试 验的每份样品内源性。
[0290] 定量方法对照（RNA酶）：定量方法对照用于验证所述方法正确进行。人DNA是该过 程的所有分析前和分析阶段期间存在的方法。DNA分离期间将总DNA标准化为lOng/μΙ浓度 并且试验50ng( = 5μ1 X lOng/μΙ)。测定起始模板原则上由人DNA(>99.995 % )组成并且通过 比较与人RNA酶P基因的检测相关的原始、实时PCR输出值Ct (VIC)估计回收率，达到验收标 准，23.00<(：^1〇<28.00(表12)。落在预期参考范围内的阈值(：^1〇验证了所述方法。 频率:为试验的每份样品内源性。
[0291] 无模板对照_(外部水空白）：设计方法空白或无模板对照(NTC)以检查样品处理和 PCR分析从头到尾的污染。在PCR设置期间除分子级无菌水代替DNA模板外，使用与试样相同 的样品试剂制备、送样和PCR程序引入无模板对照。如果无反应性，则接受NTC结果，表11。频 率:外源性，每张96孔反应板两个。
[0292] 测定标准化-公认参考标准(ARS):使用市场上可买到的爱波斯坦-巴尔病毒B95.8 定量病毒DNA对照，产品目录号08-926-000(Advanced Biotechnologies，Inc .MD 21046)， 为该项测定建立公认参考标准(ARS) (Ct真值）。
[0293] 表10.该项测定的公认参考标准
[0294]
[0295]
[0296]
[0297]
[0298] 板特异性对照:实时PCR运行的验收：
[0299] 在接受实时PCR运行之前必须满足两个标准。EBV DNA对照用作定量外部对照以验 证反应试剂盒仪器系统如同预期那样作用。3份9.25fg EBV DNA重复样品和3份92.50fg EBV DNA重复样品与临床样品并行运行。如果定量外部对照的每个Ct值都在表11提供的上 下限内，则接受实时PCR运行。一个或两个对照的失败可表明引物或探针降解、对照降解、技 术人员出错、系统问题或污染。
[0300] 由分子级水代替模板组成的两个无模板对照(NTC)在PCR设置期间未向反应引入 污染性靶核酸。如果NTCCt结果表明未反应，则接受实时PCR运行，表11。
[0301] 表11.板特异性对照
[0302]
[0303] 样品特异性对照：单项试验结果的验收：试样中的显性DNA分离物是人DNA(> 99.995%)。每个人类基因组呈单拷贝存在的人RNA酶P基因的PCR检测和扩增用作定量内部 对照。RNA酶P基因是从样本采集到最终PCR存在的方法并且用于证实单项试验结果。临床研 究确定在50ng人DNA试验质量中RNA酶P靶序列的Ct真值对应于Ct (VIC) = 25.50 ± 2.50，并 且如果定量内部对照的Ct(VIC)值在这些预期界限内，则接受单项试验结果。
[0304] 越高的Ct值可指示反应受抑制或失败、DNA提取阶段的误差、荧光测量和标准化误 差、移液误差、受损试剂或系统问题。越低的Ct(VIC)值可指示荧光测量和标准化误差、移液 误差、受损试剂或系统问题。
[0305]试验患者样品，一式两份。可由移液误差或经过热循环仪加热块的差示热分布或 其它可指定过程或设备误差引起重复试验之间大的变化。可通过监测重复试验之间的差异 限制来自这些误差的影响。基于临床研究，重复试验之间的最大容许差异：ACt(FAM)〈3和 ACt(VIC)<3〇
[0306] 表12.样品特异性对照
[0307]
[0308] 期望值:试验患者样品，一式两份并且报告附属Ct(FAM)结果。如表13所示，31.50〈 Ct (FAM)< 40.00或EDL〈1.7的测定结果指示EV相关的NPC的低可能性。28.00 < Ct (FAM)< 31.50或EDL 2 1.7和EDL < 2.6的测定结果在指示患者可能处于高于正常的发展NPC的风险 的不明确结果中。Ct(FAM)〈28.00或EDL>2.6的测定结果指示EBV相关的NPC的高可能性。 [0309] 表13.分析结果的临床意义(Ct(FAM)和EDL)
[0310]
[0311]
[0312] 灵敏度和特异性:在表14中呈现了对于该项测定在截止值Ct = 31.50时，对应于临 床诊断的临床表现。具有'初始'假阳性结果(FP)的患者的'最终'临床状态;3名患者(3/10) 最终在临床上呈现(对于NPC而言），6名患者(6/10)复检时为阴性并且因此恢复正常(TN)并 且1名患者（1/10)复检时保持其假阳性状态，无 NPC的临床证据。
[0313] 表14.在截止值Ct = 31.50时的初始和最终测定表现;在截止值Ct = 31.50时的初 始和最终测定表现。TP =真阳性，FN=假阴性，TN=真阴性，FP =假阳性
[0314]
[0315]
[0316] ^15
[0317]用于NP筛查的换算表[EDL = Log(EBV拷贝数）]
[0318]
[0319] 表16.序列表
[0320] SEQ ID NO： 1GTC TCC CCT TTG GAA TG-37
[0321] SEQ ID ^:2:57-AAT AAC AGA CAA TGG ACT CCC TTA GC-37
[0322] SEQ ID NO:3:
[0323] GTCGTCTCCCCTTTGGAATGGCCCCTGGACCCGGCCCACAACCTGGCCCGCTAAGGAGTCCATTGTCTGTTATT
[0324] SEQ ID ^:4:57-CCT GGA CCC GGC CCA CAA CC-37
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