Dna免疫吸附剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及血液净化领域,具体设及一种通过交联聚乙締醇(PVA)与DNA混合包 膜的DNA免疫吸附剂及其制备方法,运种DNA免疫吸附剂对ds-DNA有特异性吸附性。
【背景技术】
[0002] 系统性红斑狼疮(systemiclupuse巧thematosus,SLE)是一种较常见的累及多 系统多器官的自身免疫性疾病,由于患者机体免疫调节障碍及自身免疫耐受状态被打破, 产生多种自身抗体,发病机理主要是由于免疫复合物形成。多方面研究证实,抗双链DNA抗 体(抗ds-DNA抗体)与SLE疾病活动性正相关。特别是在狼疮性肾炎患者体内,抗ds-DNA 抗体与DM结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积,或ds-DNA抗体直接作用于肾小球抗 原而造成SLE患者的肾损伤。
[0003] 免疫吸附(IA)疗法是一种公认的对SLE疾病有效的血液净化方法。该方法 的特异性吸附对正常血浆成分的影响较小,吸附效率高而不良反应较小,避免了输血反 应及各种血源性传染病发生的可能性,上述优点使得IA疗法配合药物治疗在SLE的临 床治疗模式中得到越来越多的推广。其中,近十几年来发展起来一种使用DNA作为吸 附大分子的新兴疗法,运种疗法利用DNA对SLE患者血液中的致病性抗ds-DNA抗体产 生特异识别作用,通过血液灌流清除患者血液中的致病物质。美国的TermanDS等人 (Lancet, 1979, 2 (8147) : 824-7)首次使用活性炭载体,采用火棉胶包埋DNA而制成吸附剂, 成功开创了DNA吸附剂治疗SLE的先河。1987年,Jones和化ankR在欧洲专利申请号 EP0272792A1的文件中对此方法进行了详细地描述,从而推动了此方法在临床方法的应用。 本申请人依据专利化99800883. 4生产的DNA免疫吸附柱,从2005年开始在国内销售,临床 数据显示,运种DNA免疫吸附柱对SLE的具有良好的治疗效果,此吸附剂W高分子聚合形成 的Ξ元共聚超大孔树脂为原料,进行炭化、活化后得到碳化树脂载体,然后通过火棉胶包膜 方法固定DNA,从而实现对抗ds-DNA抗体的有效吸附。南开大学在申请号为CN98102355. X的中国发明专利中公开了一种碳化树脂DNA免疫吸附剂的制备方法,该方案从苯乙締、二 乙締苯和丙締腊开始,通过合成Ξ元共聚超大孔树脂,高溫下碳化得到碳化树脂,经过酸、 碱、乙醇处理后烘干,利用火棉胶包膜法,将小牛胸腺DNA固定于碳化树脂表面,得到DNA免 疫吸附剂,其可W直接用于血液灌流治疗SLE。
[0004] 可见,在现有技术中,对于火棉胶包膜DNA的方法已经得到了广泛的研究和应用, 然而,由于火棉胶溶液与DNA溶液在混合时为两相,需要通过揽拌使其分散均匀,运种过程 在工艺的实现和控制上比较复杂。另外,运种方法还存在的问题是混合不均而容易导致最 终产品的成膜的厚度不均一,运会影响产品的良品率。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中DNA免疫吸附剂采用火棉胶的包膜的厚度不均一W及吸附效率 低的问题,本发明的第一目的是提供一种DNA免疫吸附剂。
[0006] 针对现有技术中DM免疫吸附剂的制备方法中工艺复杂的问题,本发明的第二目 的是提供一种制备方法简易的DNA免疫吸附剂的制备方法。
[0007] 为了实现本发明的第一目的,本发明提供的DNA免疫吸附剂包括吸附剂载体,吸 附剂载体上负载有DNA,DNA免疫吸附剂还包括交联聚乙締醇膜,交联聚乙締醇膜对吸附剂 载体形成包膜作用。
[0008]如图1所示的聚乙締醇(PVA)是聚醋酸乙締醋水解的产物,其是一种无毒、无味的 合成高分子材料,具有良好的亲水性及成膜性。PVA的形状有片状、絮状或粉末状Ξ种固体, 它的分子结构比较规整,具有一定的结晶度,是一种半结晶性聚合物。由于PVA分子链内含 有大量的径基,因此分子内和分子间都很容易形成氨键,而大量的氨键使其具有良好的亲 水性、生物相容性和反应性。由于PVA具有良好的成膜性,其可作为载药膜用于口腔及表皮 创面,也可用于口服制剂,PVA凝胶则由于具有良好的机械性能(高弹性模量和高机械强度) 及生物相溶性,因此在药物控制释放方面有所应用。目前,PVA通过戊二醒交联制备成载药 微球而用于药物控制释放的方法已经在临床上获得了满意的疗效。
[0009]由于PVA具有良好的亲水性,因此其在水溶液中具有一定的溶胀性,但根据实际 的使用要求,一般需要对PVA的溶胀性进行改性。其中,交联是PVA改性最常用的方法,由 于PVA链中的径基比较活泼,容易与含有簇基、醒基、径基等官能团的化合物反应而在分子 间形成共价键,反应生成交联网络状结构,从而减小膜在水中的溶胀度。因此,本发明使用 交联的PVA对吸附剂载体进行包膜,通过交联作用降低了PVA的溶胀性能,使交联的PVA在 吸附剂载体表面形成稳定的膜片,而交联PVA膜可W增强DNA在吸附剂载体上固定作用,从 而更好地发挥DNA对抗双链DNA抗体的吸附性能。为了更好地说明本发明提供的DNA免疫 吸附剂具有的优异性能,在实施例部分,把本发明的DNA免疫吸附剂与传统的火棉胶包膜 经过对比的性能测试,结果表明,通过交联PVA包膜的本发明的DNA免疫吸附剂的性能优于 传统火棉胶包膜的对照样。
[0010] 一个优选的方案是,交联聚乙締醇膜的理论交联度为10%至30%。
[0011] 作为亲水性的聚合物,PVA膜在水中会逐渐溶胀或溶解,因此需要通过交联作用降 低其溶解性能,W提高其机械强度,增强膜的稳定性。按照本发明提供的制备方法,可W制 备交联度不同的交联PVA-DNA膜(由于DNA是负载在吸附剂载体上的,而交联PVA膜对吸附 剂载体包膜之后,就会增强对DNA的负载作用力,因此运种结构也可W描述为交联PVA膜与 DNA混合形成交联PVA-DNA膜,而交联PVA-DNA膜对吸附剂载体形成包膜作用)。经过实验 后发现,当PVA的理论交联度小于7%时,形成的交联PVA-DNA膜的溶胀性仍然明显并有少 量DNA脱落,而当理论交联度大于7%时,交联PVA-DNA膜有一定程度的溶胀,但DNA脱落不 明显;而当交联PVA-DNA膜的理论交联度大于15%时,交联PVA-DNA膜没有明显的溶胀且没 有检测到DNA的脱落。交联度理论上的上限为100%,实际上达不到该水平,而交联PVA膜的 强度则会随之增加,但过高的交联度会降低膜上DNA的伸展而导致吸附性能的下降。因此, 综合考虑上面的多方面因素,在保证交联PVA膜的强度及防止DNA脱落的前提下,对于不同 的吸附剂载体,优选的交联度范围应该为10%至30%,且20%为最佳交联度。
[0012] 一个优选的方案是,交联聚乙締醇膜是采用戊二醒、马来酸酢、乙二酸、丙二酸、下 二酸、己二酸或运四种酸相应的酸酢作为交联剂制备的;吸附剂载体为大孔吸附树脂或活 性炭或炭化树脂,吸附剂载体的粒径范围在0. 1毫米到1. 18毫米之间。
[0013] 如图2所示,是采用戊二醒作为交联剂与PVA的交联过程的反应式。如图3所示, 是采用马来酸酢作为交联剂与PVA的交联过程的反应式。
[0014]为了实现本发明的第二目的,本发明提供的DNA免疫吸附剂的制备方法包括W下 步骤:首先执行步骤A或步骤B;步骤A:使聚乙締醇水溶液中的聚乙締醇发生交联反应, 形成交联聚乙締醇溶液,在交联聚乙締醇溶液中加入DNA溶液,形成包膜液,加入吸附剂载 体,用包膜液对吸附剂载体进行包膜;步骤B:在聚乙締醇水溶液中加入DNA溶液后与吸附 剂载体混合,再加入交联剂和催化剂,聚乙締醇发生交联反应形成交联聚乙締醇膜,交联 聚乙締醇膜及DNA对吸附剂载体形成包膜作用;然后执行步骤C,过滤后用水洗涂至无溶剂 残留,溶液的抑接近中性;最后,干燥得到成品。
[0015] 由上述方案可见,本发明提供的DNA免疫吸附剂的制备方法简单易行,制备得到 的DNA免疫吸附剂的性质稳定。
[0016] 在实验过程中,发现理论交联度对DNA免疫吸附剂的性质具有重要影响。
[0017] 当理论交联度> 15%时,包膜顺序如果采用先交联制备包膜液再对吸附剂载体进 行负载,即按照W下第一种方法的步骤:首先配制聚乙締醇溶液;然后加入交联剂得到交 联聚乙締醇溶液,接着加入DNA溶液得到包膜液;接着再加入吸附剂载体如聚苯乙締-二乙 締大孔吸附树脂上步骤形成第一种方法的步骤A);最后经过处理得到成品;那么,按上 面的第一种方法的步骤在制备DNA免疫吸附剂时,得到的包膜液的粘度较大,无法顺利完 成包膜,并导致部分吸附剂载体成团粘结,包膜效率受到严重影响。因此,当设定理论交联 度> 15%时,应该优选采用先包膜再交联的顺序,即按照下面的第二种方法的步骤:首先配 制聚乙締醇溶液并加入DNA溶液形成包膜液;然后加入吸附剂载体;接着加入交联剂得到 交联聚乙締醇膜上步骤形成第二种方法的步骤B);最后经过后处理得到DNA免疫吸附 剂。
[001引另外,当PVA的理论交联度小于15%时,无论采用何种包膜顺序化面的第一种方 法或第二种方法),均能顺利完成对吸附剂载体的包膜。但是考虑到操作的方便性,当PVA 理论交联度小于15%时,优选的方案为按照上述第一种方法的步骤,即先交联制备包膜液, 再进行对DNA的包膜,运样得到的DNA免疫吸附剂能够取得最佳效果。
[0019] 基于上面的论述过程,一个优选的方案是,当聚乙締醇的理论交联度小于15%时, 按照上面的第一种方法制备DNA免疫吸附剂,也就是选择执行步骤A;在执行步骤C的过程 中,用滤袋过滤后加入乙醇分散吸附剂载体并渐干。
[0020] 基于上面的论述过程,另一个优选的方案是,当聚乙締醇的理论交联度在15%W 上时,按照上面的第二种方法制备DNA免疫吸附剂,也就是选择执行步骤B。
[0021]PVA溶液浓度的大小关系到交联后溶液的黏度大小。如果PVA浓度较大,则在理论 交联度较小(小于15%)的情况下,交联后的包膜液不利于在吸附剂载体上的成膜。通过制 备系列浓度的PVA溶液,在不同的交联度下试验交联PVA膜对吸附剂载体的成膜效果,结果 表明,当PVA浓度在2%。至2% (w/v)之间时,可通过上述步聚对吸附剂载体进行成膜而不影 响性能。而当PVA溶液浓度较大时巧日大于8%),即使是采用先成膜(PVA膜)再交联(交联 PVA膜)的顺序巧P按照上述第二种方法的步骤B)也会造成部分吸附剂载体的成团黏结,交 联PVA膜对吸附剂载体的包膜作用降低。因此,优选的PVA浓度范围在2%。至2% (w/v)之 间。 基于上面的论述,一个优选的方案是,聚乙締醇水溶液的浓度范围是2%。至2% (w/v)。
[0022] -个优选的方案是,加入的DM溶液与交联聚乙締醇溶液的体积比为0.8 :1至 1. 2 :1。
[0023] -个优选的方案是,聚乙締醇水溶液与DNA溶液的体积比为1:0.8至1 :1. 2。
[0024] -个优选的方案是,采用戊二醒、马来酸酢、乙二酸、丙二酸、下二酸、己二酸或运 四种酸相应的