Dna免疫吸附剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及血液净化领域，具体设及一种通过交联聚乙締醇（PVA)与DNA混合包 膜的DNA免疫吸附剂及其制备方法，运种DNA免疫吸附剂对ds-DNA有特异性吸附性。
【背景技术】
[0002] 系统性红斑狼疮（systemiclupuse巧thematosus，SLE)是一种较常见的累及多 系统多器官的自身免疫性疾病，由于患者机体免疫调节障碍及自身免疫耐受状态被打破， 产生多种自身抗体，发病机理主要是由于免疫复合物形成。多方面研究证实，抗双链DNA抗 体(抗ds-DNA抗体）与SLE疾病活动性正相关。特别是在狼疮性肾炎患者体内，抗ds-DNA 抗体与DM结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或ds-DNA抗体直接作用于肾小球抗 原而造成SLE患者的肾损伤。
[0003] 免疫吸附（IA)疗法是一种公认的对SLE疾病有效的血液净化方法。该方法 的特异性吸附对正常血浆成分的影响较小，吸附效率高而不良反应较小，避免了输血反 应及各种血源性传染病发生的可能性，上述优点使得IA疗法配合药物治疗在SLE的临 床治疗模式中得到越来越多的推广。其中，近十几年来发展起来一种使用DNA作为吸 附大分子的新兴疗法，运种疗法利用DNA对SLE患者血液中的致病性抗ds-DNA抗体产 生特异识别作用，通过血液灌流清除患者血液中的致病物质。美国的TermanDS等人 (Lancet, 1979, 2 (8147) : 824-7)首次使用活性炭载体，采用火棉胶包埋DNA而制成吸附剂， 成功开创了DNA吸附剂治疗SLE的先河。1987年，Jones和化ankR在欧洲专利申请号 EP0272792A1的文件中对此方法进行了详细地描述，从而推动了此方法在临床方法的应用。 本申请人依据专利化99800883. 4生产的DNA免疫吸附柱，从2005年开始在国内销售，临床 数据显示，运种DNA免疫吸附柱对SLE的具有良好的治疗效果，此吸附剂W高分子聚合形成 的Ξ元共聚超大孔树脂为原料，进行炭化、活化后得到碳化树脂载体，然后通过火棉胶包膜 方法固定DNA，从而实现对抗ds-DNA抗体的有效吸附。南开大学在申请号为CN98102355. X的中国发明专利中公开了一种碳化树脂DNA免疫吸附剂的制备方法，该方案从苯乙締、二 乙締苯和丙締腊开始，通过合成Ξ元共聚超大孔树脂，高溫下碳化得到碳化树脂，经过酸、 碱、乙醇处理后烘干，利用火棉胶包膜法，将小牛胸腺DNA固定于碳化树脂表面，得到DNA免 疫吸附剂，其可W直接用于血液灌流治疗SLE。
[0004] 可见，在现有技术中，对于火棉胶包膜DNA的方法已经得到了广泛的研究和应用， 然而，由于火棉胶溶液与DNA溶液在混合时为两相，需要通过揽拌使其分散均匀，运种过程 在工艺的实现和控制上比较复杂。另外，运种方法还存在的问题是混合不均而容易导致最 终产品的成膜的厚度不均一，运会影响产品的良品率。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中DNA免疫吸附剂采用火棉胶的包膜的厚度不均一W及吸附效率 低的问题，本发明的第一目的是提供一种DNA免疫吸附剂。
[0006] 针对现有技术中DM免疫吸附剂的制备方法中工艺复杂的问题，本发明的第二目 的是提供一种制备方法简易的DNA免疫吸附剂的制备方法。
[0007] 为了实现本发明的第一目的，本发明提供的DNA免疫吸附剂包括吸附剂载体，吸 附剂载体上负载有DNA，DNA免疫吸附剂还包括交联聚乙締醇膜，交联聚乙締醇膜对吸附剂 载体形成包膜作用。
[0008]如图1所示的聚乙締醇（PVA)是聚醋酸乙締醋水解的产物，其是一种无毒、无味的 合成高分子材料，具有良好的亲水性及成膜性。PVA的形状有片状、絮状或粉末状Ξ种固体， 它的分子结构比较规整，具有一定的结晶度，是一种半结晶性聚合物。由于PVA分子链内含 有大量的径基，因此分子内和分子间都很容易形成氨键，而大量的氨键使其具有良好的亲 水性、生物相容性和反应性。由于PVA具有良好的成膜性，其可作为载药膜用于口腔及表皮 创面，也可用于口服制剂，PVA凝胶则由于具有良好的机械性能(高弹性模量和高机械强度） 及生物相溶性，因此在药物控制释放方面有所应用。目前，PVA通过戊二醒交联制备成载药 微球而用于药物控制释放的方法已经在临床上获得了满意的疗效。
[0009]由于PVA具有良好的亲水性，因此其在水溶液中具有一定的溶胀性，但根据实际 的使用要求，一般需要对PVA的溶胀性进行改性。其中，交联是PVA改性最常用的方法，由 于PVA链中的径基比较活泼，容易与含有簇基、醒基、径基等官能团的化合物反应而在分子 间形成共价键，反应生成交联网络状结构，从而减小膜在水中的溶胀度。因此，本发明使用 交联的PVA对吸附剂载体进行包膜，通过交联作用降低了PVA的溶胀性能，使交联的PVA在 吸附剂载体表面形成稳定的膜片，而交联PVA膜可W增强DNA在吸附剂载体上固定作用，从 而更好地发挥DNA对抗双链DNA抗体的吸附性能。为了更好地说明本发明提供的DNA免疫 吸附剂具有的优异性能，在实施例部分，把本发明的DNA免疫吸附剂与传统的火棉胶包膜 经过对比的性能测试，结果表明，通过交联PVA包膜的本发明的DNA免疫吸附剂的性能优于 传统火棉胶包膜的对照样。
[0010] 一个优选的方案是，交联聚乙締醇膜的理论交联度为10%至30%。
[0011] 作为亲水性的聚合物，PVA膜在水中会逐渐溶胀或溶解，因此需要通过交联作用降 低其溶解性能，W提高其机械强度，增强膜的稳定性。按照本发明提供的制备方法，可W制 备交联度不同的交联PVA-DNA膜（由于DNA是负载在吸附剂载体上的，而交联PVA膜对吸附 剂载体包膜之后，就会增强对DNA的负载作用力，因此运种结构也可W描述为交联PVA膜与 DNA混合形成交联PVA-DNA膜，而交联PVA-DNA膜对吸附剂载体形成包膜作用）。经过实验 后发现，当PVA的理论交联度小于7%时，形成的交联PVA-DNA膜的溶胀性仍然明显并有少 量DNA脱落，而当理论交联度大于7%时，交联PVA-DNA膜有一定程度的溶胀，但DNA脱落不 明显；而当交联PVA-DNA膜的理论交联度大于15%时，交联PVA-DNA膜没有明显的溶胀且没 有检测到DNA的脱落。交联度理论上的上限为100%，实际上达不到该水平，而交联PVA膜的 强度则会随之增加，但过高的交联度会降低膜上DNA的伸展而导致吸附性能的下降。因此， 综合考虑上面的多方面因素，在保证交联PVA膜的强度及防止DNA脱落的前提下，对于不同 的吸附剂载体，优选的交联度范围应该为10%至30%，且20%为最佳交联度。
[0012] 一个优选的方案是，交联聚乙締醇膜是采用戊二醒、马来酸酢、乙二酸、丙二酸、下 二酸、己二酸或运四种酸相应的酸酢作为交联剂制备的；吸附剂载体为大孔吸附树脂或活 性炭或炭化树脂，吸附剂载体的粒径范围在0. 1毫米到1. 18毫米之间。
[0013] 如图2所示，是采用戊二醒作为交联剂与PVA的交联过程的反应式。如图3所示， 是采用马来酸酢作为交联剂与PVA的交联过程的反应式。
[0014]为了实现本发明的第二目的，本发明提供的DNA免疫吸附剂的制备方法包括W下 步骤：首先执行步骤A或步骤B;步骤A:使聚乙締醇水溶液中的聚乙締醇发生交联反应， 形成交联聚乙締醇溶液，在交联聚乙締醇溶液中加入DNA溶液，形成包膜液，加入吸附剂载 体，用包膜液对吸附剂载体进行包膜；步骤B:在聚乙締醇水溶液中加入DNA溶液后与吸附 剂载体混合，再加入交联剂和催化剂，聚乙締醇发生交联反应形成交联聚乙締醇膜，交联 聚乙締醇膜及DNA对吸附剂载体形成包膜作用；然后执行步骤C，过滤后用水洗涂至无溶剂 残留，溶液的抑接近中性；最后，干燥得到成品。
[0015] 由上述方案可见，本发明提供的DNA免疫吸附剂的制备方法简单易行，制备得到 的DNA免疫吸附剂的性质稳定。
[0016] 在实验过程中，发现理论交联度对DNA免疫吸附剂的性质具有重要影响。
[0017] 当理论交联度> 15%时，包膜顺序如果采用先交联制备包膜液再对吸附剂载体进 行负载，即按照W下第一种方法的步骤：首先配制聚乙締醇溶液；然后加入交联剂得到交 联聚乙締醇溶液，接着加入DNA溶液得到包膜液；接着再加入吸附剂载体如聚苯乙締-二乙 締大孔吸附树脂上步骤形成第一种方法的步骤A);最后经过处理得到成品；那么，按上 面的第一种方法的步骤在制备DNA免疫吸附剂时，得到的包膜液的粘度较大，无法顺利完 成包膜，并导致部分吸附剂载体成团粘结，包膜效率受到严重影响。因此，当设定理论交联 度> 15%时，应该优选采用先包膜再交联的顺序，即按照下面的第二种方法的步骤：首先配 制聚乙締醇溶液并加入DNA溶液形成包膜液；然后加入吸附剂载体；接着加入交联剂得到 交联聚乙締醇膜上步骤形成第二种方法的步骤B);最后经过后处理得到DNA免疫吸附 剂。
[001引另外，当PVA的理论交联度小于15%时，无论采用何种包膜顺序化面的第一种方 法或第二种方法)，均能顺利完成对吸附剂载体的包膜。但是考虑到操作的方便性，当PVA 理论交联度小于15%时，优选的方案为按照上述第一种方法的步骤，即先交联制备包膜液， 再进行对DNA的包膜，运样得到的DNA免疫吸附剂能够取得最佳效果。
[0019] 基于上面的论述过程，一个优选的方案是，当聚乙締醇的理论交联度小于15%时， 按照上面的第一种方法制备DNA免疫吸附剂，也就是选择执行步骤A;在执行步骤C的过程 中，用滤袋过滤后加入乙醇分散吸附剂载体并渐干。
[0020] 基于上面的论述过程，另一个优选的方案是，当聚乙締醇的理论交联度在15%W 上时，按照上面的第二种方法制备DNA免疫吸附剂，也就是选择执行步骤B。
[0021]PVA溶液浓度的大小关系到交联后溶液的黏度大小。如果PVA浓度较大，则在理论 交联度较小（小于15%)的情况下，交联后的包膜液不利于在吸附剂载体上的成膜。通过制 备系列浓度的PVA溶液，在不同的交联度下试验交联PVA膜对吸附剂载体的成膜效果，结果 表明，当PVA浓度在2%。至2% (w/v)之间时，可通过上述步聚对吸附剂载体进行成膜而不影 响性能。而当PVA溶液浓度较大时巧日大于8%)，即使是采用先成膜（PVA膜）再交联(交联 PVA膜）的顺序巧P按照上述第二种方法的步骤B)也会造成部分吸附剂载体的成团黏结，交 联PVA膜对吸附剂载体的包膜作用降低。因此，优选的PVA浓度范围在2%。至2% (w/v)之 间。 基于上面的论述，一个优选的方案是，聚乙締醇水溶液的浓度范围是2%。至2% (w/v)。
[0022] -个优选的方案是，加入的DM溶液与交联聚乙締醇溶液的体积比为0.8 :1至 1. 2 :1。
[0023] -个优选的方案是，聚乙締醇水溶液与DNA溶液的体积比为1:0.8至1 :1. 2。
[0024] -个优选的方案是，采用戊二醒、马来酸酢、乙二酸、丙二酸、下二酸、己二酸或运 四种酸相应的